《LWT》：Design and Chromatography-Free Purification of a Recombinant Helix-bundle AMP with Potent Antibacterial Activity for Pork Preservation
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本文针对抗菌肽（AMP）作为食品防腐剂应用时存在的稳定性差、生产成本高等难题，报道了一种基于超稳定四螺旋束结构域（DAMP4）与PR-FO抗菌肽的嵌合融合策略。研究通过毕赤酵母表达系统，结合选择性热沉淀技术实现无色谱纯化，获得高纯度（85.19%）、高产率（79.02 mg/L）的重组肽rD2L。该肽表现出广谱抗菌活性（GMMIC=2.31 μmol/L），并兼具耐蛋白酶、耐热和耐生理盐等特性，其机制主要通过膜去极化/破坏及DNA结合作用协同杀菌，显著延缓冷藏猪肉腐败。该研究为AMP的低成本生物制造与功能强化提供了集成化解决方案。
随着食品安全问题日益受到关注，开发高效、安全的天然防腐剂成为研究热点。抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）因其广谱抗菌性和不易诱发耐药性等优势，被视为传统化学防腐剂的理想替代品。然而，AMPs在实际应用中面临稳定性差、生产成本高、作用机制不明确等瓶颈。例如，常见的AMPs在复杂食品环境中易被蛋白酶降解，且化学合成或传统重组表达方式成本高昂，限制了其产业化应用。为此，研究者致力于通过蛋白质工程手段提升AMPs的稳定性并简化生产工艺。
本研究发表于《LWT》期刊，创新性地将具有超稳定性的四螺旋束结构域（DAMP4）与抗菌肽PR-FO融合，利用毕赤酵母表达系统实现高效分泌表达，并开发了基于热稳定性的无色谱纯化工艺。该策略不仅显著提升了抗菌肽的稳定性，还大幅降低了下游纯化成本，为AMPs的食品工业应用提供了新思路。
研究团队通过基因工程构建了DAMP4与PR-FO的融合变体（DK/DL/D2L），优化发酵条件后采用选择性热沉淀法纯化目标蛋白。通过圆二色谱分析蛋白二级结构，并系统评估了抗菌活性、毒性、稳定性及作用机制。最后以冷藏猪肉为模型验证其保鲜效果。
3.1. 目标基因设计与重组毕赤酵母构建
通过柔性连接子将DAMP4与PR-FO连接，成功构建重组菌株，并筛选多拷贝整合子确保表达稳定性。
3.2. 重组肽表达与发酵条件优化
在摇瓶发酵中，通过优化诱导时间、甲醇浓度和pH值，使重组蛋白产量最高达259.6 mg/L，且表达水平与菌体生长呈正相关。
3.3. rDK、rDL、rD2L及rPR-FO的纯化
利用DAMP4的热稳定性，建立“加热-盐析”纯化流程，在90°C、1 mol/L Na2SO4条件下获得纯度85.19%的rD2L，产量为79.02 mg/L，较传统色谱法成本显著降低。
3.4. 重组肽二级结构分析
圆二色谱显示DAMP4修饰的肽在高温和高盐条件下仍保持α-螺旋结构，其中rD2L的螺旋含量最高，印证其结构稳定性。
3.5. 体外抗菌活性与毒性评估
rD2L对革兰氏阴/阳性菌均表现出强效抗菌活性（GMMIC=2.31 μmol/L），且溶血性和细胞毒性低，选择性指数（SI）达55.40，安全性优于对照肽Melittin。
3.6. 生理盐、血清、热及蛋白酶耐受性
rD2L在高浓度盐离子、血清、高温（100°C）及蛋白酶处理下活性保持稳定，尤其在胰蛋白酶和糜蛋白酶作用下MIC仅增加1.34倍，显著优于未修饰PR-FO。
3.7. rD2L的抗菌机制
rD2L通过破坏细菌外膜通透性、细胞膜完整性及引起膜电位去极化直接杀伤细菌，并能结合细菌DNA抑制复制转录。连续传代实验表明其不易诱导耐药性。
3.8. 猪肉保鲜性能
在冷藏猪肉模型中，rD2L有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌增殖，延缓脂质氧化和pH上升，维持肉质色泽和质构，保鲜效果优于Nisin。
本研究通过螺旋束结构域融合策略，成功解决了抗菌肽稳定性与生产成本的双重挑战。重组肽rD2L不仅具备强效抗菌活性和高安全性，其耐热、耐蛋白酶特性更适用于食品加工环境。所建立的无色谱纯化工艺为AMP的规模化生产提供了新范式。此外，多靶点杀菌机制显著降低耐药性风险，其在猪肉保鲜中的成功应用验证了其作为天然防腐剂的潜力。该研究为功能性肽的理性设计和低成本制造提供了重要技术支撑，对推进食品工业的绿色转型具有深远意义。
