《Scientific Reports》：Three-dimensional reconstruction of a biliary system in a bioengineered liver using decellularized scaffold
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本研究针对生物工程肝中胆道系统整合重建的难题，通过将大鼠原代肝细胞(PHs)和表达绿色荧光蛋白(GFP)的肝内胆管类器官(ICOs)共植入脱细胞大鼠肝支架，成功实现了三维胆道结构的形态学重建。研究发现，在特定区域形成了MRP2阳性PHs与KRT19阳性ICO衍生细胞相互粘附的类原生肝结构，且伴随胆道引流液中总胆汁酸浓度升高趋势。该成果为发展可用于移植的生物工程肝提供了关键技术支持。
对于终末期肝病患者而言，肝移植是唯一的根治性治疗手段，但供体肝脏的严重短缺始终是制约临床救治的世界性难题。生物工程肝被视为最有潜力的替代方案，其核心在于构建出既具备实质细胞功能、又拥有完整胆道系统的类器官。尽管通过脱细胞技术获得的天然支架已显示出良好的临床应用前景，但如何在其中重建一个结构与功能均完善的胆道系统，特别是实现肝细胞与胆管细胞的有机整合，一直是该领域难以逾越的技术瓶颈。胆道系统负责胆汁的排泄，若功能不全将导致胆汁淤积，严重影响移植后的肝细胞存活和功能发挥。因此，突破胆道系统重建的瓶颈，是推动生物工程肝从实验室走向临床的关键一步。
为了攻克这一难题，研究人员在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究。他们巧妙地利用脱细胞支架的天然三维结构，尝试将两种关键的肝脏细胞——负责代谢功能的原代肝细胞(Primary Hepatocytes, PHs)和构成胆道壁的肝内胆管类器官(Intrahepatic Cholangiocyte Organoids, ICOs)——进行协同植入，旨在模拟肝脏原生的复杂胆道架构，并评估其功能关联性。
本研究主要采用了几个关键技术方法：首先，使用脱细胞技术制备大鼠肝脏支架以保留天然三维结构和细胞外基质；其次，通过胆道注射将表达绿色荧光蛋白(GFP)的大鼠肝内胆管类器官(ICOs)植入支架的胆道网络；随后，通过门静脉灌注植入大鼠原代肝细胞(PHs)；最后，利用灌注生物反应器系统进行共培养，以模拟体内的血流和营养环境，并收集胆道引流液和培养基进行胆汁酸浓度分析。
组织学分析确认细胞成功植入
经过7天的灌注培养后，组织学分析证实，表达GFP的ICOs成功定植于支架的胆道结构中，而PHs则均匀分布于支架的肝实质区域。这表明脱细胞支架的微环境能够支持两种关键肝脏细胞的存活和特异性归巢。
植入的PHs形成功能性胆小管
免疫荧光分析显示，植入的PHs表达了紧密连接蛋白ZO-1和多药耐药相关蛋白2(MRP2)，这两种蛋白是形成功能性胆小管（bile canaliculi）的标志。ZO-1确保了肝细胞间紧密连接的形成，而MRP2是胆小管膜上的胆汁酸外排泵。这一结果证明，在生物工程肝中再生的肝细胞具有极化特性，并能够形成排泄胆汁的基本功能单位。
再现类原生肝的胆管-肝细胞界面
研究在特定区域观察到了一个关键结构：表达MRP2的PHs（肝细胞侧）和表达细胞角蛋白19(KRT19)的ICO来源的细胞（胆管细胞侧）相互紧密粘附。这种结构模拟了体内肝脏中胆小管与Hering管连接的胆管-肝细胞界面，是胆汁从肝细胞排入胆道系统的关键过渡区域。该结构的出现，标志着三维胆道系统在结构整合上取得了重要进展。
胆汁酸分布提示功能相关性
为了评估重建结构的功能相关性，研究人员比较了胆道引流液和培养基中的总胆汁酸浓度。在成功再现了上述胆管-肝细胞界面结构的样本中，胆道引流液内的胆汁酸浓度呈现出高于培养基的趋势。这一发现提示，结构上的成功重建可能与胆汁排泄功能的初步恢复存在关联，胆汁可能更倾向于通过重建的胆道系统排出，而非泄漏到周围环境中。
综上所述，本研究通过将PHs和ICOs序贯植入脱细胞肝支架并进行灌注共培养，成功实现了生物工程肝内三维胆道系统的结构重建。研究不仅证实了细胞在支架内的成功定植和分化（形成具有MRP2和ZO-1的胆小管），更重要的是，在部分区域再现了连接肝细胞与胆管细胞的类原生界面结构，并且观察到了与该结构相关的胆汁酸分布变化。这项研究为构建结构完整、功能协同的生物工程肝提供了直接的结构性证据，是朝着最终实现可用于移植的功能性生物工程肝迈出的坚实一步。其意义在于证明利用脱细胞支架的天然蓝图，结合合适的细胞来源和培养技术，有望解决生物工程器官中血管化、胆道化等多系统整合的核心挑战。未来的研究将需要进一步延长培养时间，并深入评估重建胆道系统的长期功能稳定性及其在动物模型中的治疗效果。
