《Scientific Reports》：The single-cell transcriptional landscape of the pediatric cystic fibrosis lung from minimally invasive respiratory specimens
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本研究为解决囊性纤维化(CF)肺部疾病的早期发病机制和不可逆损伤问题，研究人员对经柔性支气管镜采集的微创呼吸样本开展单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析，揭示了儿科CF肺部存在以中性粒细胞为主的高度紊乱炎症反应及伴随的促炎性气道上皮，并发现这些特征在CFTR调节剂治疗下仍持续存在。该研究为在生命全程中监测和干预CF等呼吸道疾病的细胞动态变化提供了新工具和见解。
囊性纤维化(CF)是一种令人困扰的遗传性疾病，其核心问题在于一个名为CFTR(囊性纤维化跨膜传导调节因子)的蛋白质功能发生障碍。这种故障导致患者体内黏液变得异常黏稠，难以清除，从而在多个器官系统，尤其是肺部引发一系列问题。在肺部，这种黏稠的黏液成为了细菌滋生的“温床”，进而诱发持续且剧烈的炎症反应。多年来，临床观察表明，CF患者的肺部很早就出现了以中性粒细胞为主导的严重炎症。这种炎症如同一把“双刃剑”，它在试图清除感染的同时，也会“误伤”正常的肺组织，被认为是导致肺部组织损伤、功能下降，并最终形成不可逆结构性肺病的关键推手。然而，这种破坏性的炎症过程究竟是如何在疾病的早期阶段启动和维持的？构成肺部微环境的各类细胞，特别是免疫细胞和气道表层的气道上皮细胞，在其中扮演了怎样的角色？它们之间又是如何“对话”并共同推动疾病进展的？这些核心问题，由于缺乏能够在人体中，尤其是在儿童患者身上，进行高分辨率、无创或微创研究的手段，一直未能被清晰阐明。传统的活检创伤大，不适合儿童患者反复进行，而痰液等样本又难以精确反映下呼吸道的真实细胞状态。因此，开发一种能够深入“窥探”活体患者，特别是儿科患者肺部细胞世界的方法，对于理解CF的发病根源、寻找早期干预靶点、评估现有CFTR调节剂疗法的真实效果，乃至最终改变疾病的自然病程，都具有至关重要的意义。这正是本篇发表在《Scientific Reports》上的研究所致力于回答的科学挑战。
为了回答这些问题，研究人员开展了一项创新性的探索。他们巧妙地将单细胞RNA测序(scRNA-seq)这一强大的技术，应用于通过柔性支气管镜检查这一相对微创的方式从儿科CF患者呼吸道收集的标本上。这种方法使得研究者能够以前所未有的分辨率，在单个细胞的层面上，对患者肺部复杂的细胞组成、基因表达状态以及细胞间的信号交流进行全景式解析。通过这项技术，研究人员得以绕过传统方法的局限，直接解码来自活体患儿肺部的细胞“密码”。
本研究为开展这项前沿分析，主要依托于几个关键的技术方法。研究的核心是应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术对从研究对象获取的呼吸道细胞进行高通量测序分析。所有用于分析的细胞样本均来源于通过柔性支气管镜检查这一临床常规操作采集的、创伤性相对较低的呼吸道标本。在获得样本后，研究团队利用流式细胞分选技术对样本中的有核细胞进行了富集，以去除可能干扰测序质量的碎片和死细胞。随后，通过基于液滴的微流控单细胞捕获系统，成功构建了单细胞转录组文库，并进行了高通量测序。对产生的海量测序数据，研究人员采用了生物信息学流程进行处理，包括基因表达定量、质量控制、批次效应校正、降维聚类以识别不同的细胞群体，并进一步通过细胞类型特异性标记基因的表达对聚类结果进行注释，从而解析出样本中存在的各种免疫细胞和上皮细胞亚群。此外，研究还运用了细胞间通讯网络分析算法，基于配体-受体相互作用对，系统地推断和可视化不同细胞类型之间潜在的信号传导网络。
本研究通过细致的单细胞测序与生物信息学分析，揭示了儿科囊性纤维化肺部独特且复杂的细胞景观，主要结果可归纳为以下几个部分：
应用单细胞RNA测序(scRNA-seq)解析儿科CF患者呼吸样本的细胞组成
通过对一名婴儿和一名青少年CF患者呼吸道样本的scRNA-seq分析，研究人员成功绘制了其肺部的单细胞转录组图谱。分析揭示了两名患者样本中存在高度相似的细胞群落结构，主要包括两大类：免疫细胞和上皮细胞。在免疫细胞中，中性粒细胞是绝对的主导群体。这些中性粒细胞显示出独特的、高度活化的转录状态，其基因表达特征明确指向它们处于一种强烈的促炎和活化状态。与此同时，气道上皮细胞的分析也显示出明显的异常。与健康状态不同，CF患者的气道上皮细胞整体表现出广泛的促炎症反应特征，多种与炎症信号通路相关的基因被显著上调。值得注意的是，这名青少年患者当时正在接受高效的CFTR调节剂治疗，但其肺部样本中依然清晰地存在着这种以活化中性粒细胞为主的高度炎症环境以及气道上皮细胞的促炎状态。这一发现强烈提示，这种紊乱的炎症程序在CF病程中启动得非常早，并且可能具有相当的顽固性，即使在针对疾病根本原因（CFTR蛋白功能缺陷）的 modulator 疗法下，一旦相关的结构性肺病改变确立，这种炎症状态也难以被轻易逆转。
中性粒细胞与气道上皮细胞之间异常活跃的细胞间通讯网络
为了深入探究驱动和维持这种异常炎症微环境的潜在机制，研究人员对测序数据进行了细胞间通讯网络分析。该分析专注于不同细胞群体之间通过配体-受体对进行的潜在信号“对话”。结果显示，在CF患者的肺部细胞互作网络中，存在一个异常活跃和复杂的通信网络，其中中性粒细胞和气道上皮细胞是网络中的核心节点。分析发现了多条潜在的、连接这两种细胞类型的信号通路。特别值得注意的是，一些已知的、能够强力招募和激活中性粒细胞的细胞因子（例如白介素-1家族成员、白介素-17等）及其受体，在上皮细胞和中性粒细胞之间构成了增强的信号回路。这意味着，活化的气道上皮细胞可能通过持续释放这些信号分子，不断地“呼唤”和“激活”更多的中性粒细胞向肺部聚集；而浸润和活化的大量中性粒细胞本身又会释放更多的炎症介质，形成一个正反馈循环，进一步刺激气道上皮细胞和其他细胞，从而导致炎症反应的不断放大和持续。这种紊乱的细胞间“对话”，很可能正是CF肺部破坏性炎症得以长期维持并不断加剧的关键细胞分子机制之一。
综上所述，本研究通过对儿科囊性纤维化患者微创呼吸道样本的单细胞测序分析，得出核心结论：即便在生命早期，CF患者的肺部也已建立起一个以中性粒细胞绝对主导、高度活化的破坏性炎症环境，同时伴随气道上皮细胞广泛的促炎症反应状态。这种异常状态在已接受CFTR调节剂治疗的青少年患者中依然持续存在，提示其可能是疾病早期启动、一旦结构改变形成便难以逆转的共性病理程序。更为重要的是，研究通过细胞间通讯网络分析，揭示了气道上皮细胞与中性粒细胞之间存在的异常活跃的信号交流网络，为理解这种持续性炎症的维持机制提供了新的视角，指出了上皮细胞在调控CF肺部炎症中的潜在核心作用。这项研究的重大意义在于，它所建立并验证的、基于临床微创样本的单细胞测序工作流程，为在CF乃至其他呼吸道疾病的整个生命历程中，动态、纵向地研究疾病相关变化开辟了全新的道路。该技术使得研究者能够无创或微创地反复获取“活体活检”，从而实时监测肺部免疫细胞和上皮细胞群体在疾病发生、发展、治疗干预过程中的组成、功能状态和相互作用网络的动态演变。这不仅极大深化了我们对CF早期发病机制的理解，更重要的是，它为未来发现新的疾病生物标志物、评估现有及新兴疗法（如CFTR调节剂、抗炎治疗）的真实疗效与作用机制，以及最终开发能够精准中断特定有害细胞互作、改变疾病进程的靶向治疗策略，提供了强大的研究工具和坚实的科学基础。
