《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Gut Microbiota-Derived Metabolites Regulate CASP3 and Neuroimmune Pathways in Multiple Sclerosis: An Integrative Multiomics Study
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本文通过整合网络药理学、机器学习与单细胞转录组分析，首次揭示肠道菌群代谢物（如L-异亮氨酸、芳香乳酸衍生物等）通过调控CASP3核心靶点，参与TNF/MAPK/IL-17等信号通路，影响多发性硬化（MS）的神经免疫机制。研究结合孟德尔随机化（MR）与SHAP模型验证因果关联，发现特定菌属（如Akkermansia、Bifidobacterium）与代谢物协同调节胶质细胞通讯，为肠道-CNS轴干预策略提供新靶点。
研究背景与方法框架
多发性硬化（MS）作为一种慢性自身免疫性中枢神经系统疾病，其发病与神经炎症、免疫失调及肠道菌群失衡密切相关。近年来，肠道菌群衍生代谢物通过“肠-脑轴”调控MS病理进程的机制备受关注。本研究采用整合多组学策略，联合网络药理学、机器学习（ML）与单细胞转录组分析，系统探索肠道微生物代谢物对MS关键靶点的调控作用。研究首先通过差异表达基因（DEGs）筛选（标准：|log2FC|≥1，校正后p≤0.05）与肠道菌群代谢物靶点预测（基于gutMGene、SEA及SwissTargetPrediction数据库），获得57个候选基因。进一步通过富集分析、蛋白互作网络（PPI）及多种机器学习算法（包括随机森林、支持向量机等）筛选核心靶点，并利用SHapley加性解释（SHAP）模型评估特征贡献度，同时通过孟德尔随机化（MR）验证基因与MS的因果关系。
核心靶点发现与功能验证
通过机器学习模型与CytoHubba算法交叉验证，研究确定CASP3、EP300和CCNA2为MS相关核心靶点，其中CASP3（半胱天冬酶-3）在MR分析中显示显著遗传关联（IVW法β=0.611，p=0.021）。单细胞转录组分析表明，CASP3在MS患者脑脊液（CSF）的星形胶质细胞中高表达，且主要定位于核质与线粒体。功能富集分析提示，CASP3参与细胞凋亡、炎症反应及神经免疫调节，其相关通路涉及TNF、MAPK、IL-17、Wnt等经典信号网络。此外，研究通过构建miRNA-TF-mRNA调控网络，发现CASP3受49个miRNA和4个转录因子（如SP1、RELA）的协同调控，进一步揭示其上游分子机制。
肠道菌群代谢物与靶点互作网络
研究从gutMGene数据库筛选出251种潜在肠道菌群代谢物，通过分子对接与药物相似性评估，最终确定9种具有低毒性、高结合活性的代谢物（如L-异亮氨酸、3-羟基-2-甲基丁酸、D-木糖等）。分子对接结果显示，8种代谢物与CASP3结合能低于-5 kcal/mol，其中3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸结合能最低（-6.3 kcal/mol），提示其可能通过抑制CASP3活性发挥神经保护作用。菌群-代谢物-靶点（G-M-T）网络分析表明，特定菌属（如Akkermansia、Bacteroides）与代谢物密切关联，其中短链脂肪酸（SCFA）产生菌（如Bifidobacterium）的减少可能与MS患者免疫失衡相关。
单细胞层面的免疫细胞通讯解析
基于MS患者CSF的单细胞RNA测序数据，研究识别出T细胞、单核细胞、NK细胞和B细胞四大免疫亚群，并发现CASP3在T细胞与B细胞中表达显著。细胞通讯分析显示，半乳糖凝集素（galectin）信号通路是介导免疫细胞交互的核心途径，其中单核细胞通过LGALS9-CD44/LGALS9-CD45配体-受体对向NK细胞与T细胞传递信号，而半乳糖凝集素-9（Gal-9）可能通过激活TGF-β受体或NK细胞CD44参与免疫耐受调节。这一发现为MS中神经炎症的细胞间对话机制提供了新视角。
代谢物的治疗潜力与安全性
通过Lipinski五规则与毒性预测模型，研究评估了9种核心代谢物的成药性，结果显示其均符合药物相似性标准且无预测肝毒性、神经毒性等风险。例如，L-异亮氨酸在MS患者血浆中水平升高，可能与神经丝轻链（NfL）相关的神经损伤相关；而芳香乳酸衍生物（如3-羟基苯乙醇）具有抗氧化与抑制小胶质细胞炎症因子释放的潜力。这些代谢物通过调节CASP3及相关通路，可能成为MS干预的潜在先导化合物。
研究局限与展望
本研究通过计算生物学手段系统阐释了肠道菌群代谢物经CASP3靶点调控MS神经免疫通路的网络框架，但结果仍需实验验证。未来需利用MS动物模型或细胞实验验证代谢物对CASP3的直接调控作用，并深入探索菌群-代谢物-CNS轴的具体分子机制。此外，当前数据库覆盖度有限，后续可结合宏基因组学与代谢组学数据，动态解析菌群代谢在MS病程中的演变规律。
结论
本研究整合多组学与人工智能方法，揭示CASP3是肠道菌群代谢物调控MS的关键靶点，其中L-异亮氨酸、3-羟基苯乙醇等代谢物可能通过TNF/MAPK/IL-17等通路影响神经免疫应答。特定菌群（如Akkermansia、Bifidobacterium）及其代谢物通过半乳糖凝集素信号通路参与免疫细胞通讯，为MS的肠道微生物干预提供新策略。研究成果为深入理解“肠-脑轴”在MS中的作用及开发靶向治疗奠定理论基础。
