《Journal of Medical Virology》：Development of a Fully Automated, High-Throughput Molecular Assay for Detection of Rat Hepatitis E Virus in Routine Diagnostics
编辑推荐：
本文开发并验证了一种符合欧盟体外诊断法规（IVDR）的全自动高通量大鼠肝炎E病毒（ratHEV）RT-qPCR检测方法。该方法在cobas系统上展示出优异性能：血浆检测限（LoD）98.9拷贝/毫升，粪便60.3拷贝/毫升，线性范围超5个数量级（r2>0.99），可精准识别不同ratHEV C1亚型。研究填补了人源样本中新型人畜共患病原体的诊断空白，为临床监测提供标准化工具。
摘要
近年来，大鼠肝炎E病毒（ratHEV，学名Rocahepevirus ratti）的人类感染病例在全球范围内持续出现。由于ratHEV与人类HEV基因1-4型（Paslahepevirus balayani）存在显著遗传差异，现有HEV诊断方法无法有效检测ratHEV。本研究旨在建立并验证一种实验室自主研发的ratHEV RT-qPCR检测方法，适用于全自动高通量平台（cobas 5800/6800/8800系统）上的人体血浆和粪便样本检测。
1 引言
正肝病毒亚科（Orthohepevirinae）病毒可感染人类和多种动物，引起急慢性肝炎及肝外临床表现。2010年，德国野生褐家鼠中首次发现新型肝病毒，现归类为Rocahepevirus ratti。其C1基因型（即ratHEV）已在全球多国人类病例中检出，被视为新发人畜共患病原体。由于ratHEV与Paslahepevirus balayani核苷酸序列相似性仅55%-60%，常规HEV RT-qPCR检测存在漏检风险。本研究通过优化引物探针体系，建立了符合欧盟IVDR标准的全自动检测方案。
2 材料与方法
2.1 检测体系设计
采用经修饰的引物探针组（HEC-FO1/HEC-qual-FO2/HEC-qual-RO/HEC-probe），通过2′-O-甲基RNA修饰减少引物二聚体形成，双淬灭探针提升信噪比。试剂盒包含内参RNA全流程控制（IC），可同步监控核酸提取与扩增效率。
2.2 分析性能评估
使用基于人源ratHEV毒株（MN450851.1）的细胞培养物作为标准品，通过数字PCR定量。检测限（LoD）采用5%概率单位分析法确定，线性范围通过多项式拟合验证，精密度通过连续3天重复检测计算方差。
2.3 特异性与包容性验证
包容性测试涵盖ratHEV C1a-d亚型、C2型（鼬科动物）及其他Rocahepevirus物种（C3/C4）。特异性测试包括WHO HEV基因型参考品（11种亚型）、41种常见病原体交叉反应验证。
3 结果
3.1 引物探针覆盖度
序列比对显示，引物探针可完全覆盖ratHEV C1亚型（0-1个错配），C2型存在1-2个探针错配，C3/C4型因超过5个错配无法检测。
3.2 分析性能
血浆LoD为98.9拷贝/毫升（95%CI: 71.3-162.0），粪便LoD为60.3拷贝/毫升（95%CI: 39.8-188.0）。线性范围达5个数量级（血浆r2=0.991，粪便r2=0.9989），高/低浓度样本批内批间变异系数（CV）均<0.62 Ct。
3.3 临床样本验证
所有11份ratHEV阳性鼠肝样本（Ct中位数16.4）及1例人源阳性血浆（Ct 31.9）均被成功检出，而商用HEV检测试剂（罗氏CE-IVD）及实验室自建HEV检测均呈阴性。WHO HEV参考品及其他病原体未见交叉反应。
3.4 初步流行病学调查
1999份临床血浆样本（含737例免疫抑制患者）中，1.1%（19/1773）为HEV RNA阳性，但未发现ratHEV感染病例。
4 讨论
本研究建立的ratHEV检测方法具备高灵敏度、宽线性范围和优异精密度，填补了人源样本中新型人畜共患病原体的诊断空白。尽管初步监测未发现ratHEV流行证据，但其在废水、鼠群中的高检出率提示需持续监测。未来需扩大临床研究以明确感染途径与致病机制。
创新点
首次在全自动平台上实现符合IVDR标准的ratHEV检测，为规模化临床筛查提供标准化方案；通过多维度验证证实方法对不同基因型的覆盖能力，为新型人畜共患病监测树立技术范式。
