综述：用于生物相互作用分析的微尺度亲和色谱：策略、原理与应用

《Journal of Separation Science》：Microscale Affinity Chromatography for Biointeraction Analysis: Strategies, Principles and Applications

本综述系统评述了微尺度亲和色谱（μAC）在生物相互作用研究中的前沿进展，重点介绍了其基于固定化生物结合剂（如抗体、酶、血清蛋白等）的核心原理，详细阐释了区带分析（zonal analysis）、前沿分析（frontal analysis）及多种动力学研究方法（如板高法、峰形分析法、分流峰法、峰衰减法和超快亲和萃取UAE）在药物-蛋白相互作用（如HSA、AGP）、受体-配体信号传导等研究中的应用，凸显了μAC技术具有样品消耗少、分析速度快、易于自动化及与多种检测技术（如质谱）联用等突出优势，为生物医学、制药及环境科学领域的分子识别研究提供了强大工具。

微尺度亲和色谱（μAC）作为亲和色谱（AC）与高效亲和色谱（HPAC）的重要分支，因其在微小尺度（柱体积低至微升级）上操作，并仅需少量样品和结合剂，已成为研究生物相互作用的强大工具。其核心在于将具有生物特异性的结合剂（即“亲和配体”，如抗体、酶、血清蛋白、核酸、适体、分子印迹聚合物等）固定于色谱载体作为固定相，用于直接研究该配体与目标分析物（溶质）的相互作用，或作为二级捕获剂探测溶液相中的相互作用。

μAC的优势源于其高选择性和强结合特性。根据色谱通用分离度方程（R_s= (√N/4) × [(α-1)/α] × [k₂/(1+k₂)]），即使柱效（N）因色谱柱尺寸缩小（如从常规的25 cm × 4.6 mm内径柱缩短至5 mm × 4.6 mm内径的微柱）而显著降低，由于分离因子（α）和保留因子（k₂）值通常很大，仍能获得良好的分离效果。这使得μAC平台形式多样，包括亲和微柱、亲和碟片、夹心柱、毛细管柱以及微芯片/微流体系统等，兼容从nL/min到mL/min的流速范围，并易于与紫外、荧光、质谱等多种检测器联用。

2 微尺度亲和色谱的一般原理

μAC基于生物分子间可逆的相互作用，其基本模型描述分析物（A）与固定化配体（L）形成可逆复合物（A-L）的1:1结合反应（A + L ? A-L）。该过程的平衡由结合常数（K_a）和解离常数（K_d= 1/K_a）描述，动力学则由结合速率常数（k_a）和解离速率常数（k_d）表征。μAC特别适用于研究具有中等到强结合力（K_a值较大）且具有一定选择性的系统。

3 微尺度亲和色谱中的区带分析

区带分析是μAC中研究生物相互作用的常用格式。该方法将少量目标分析物或探针化合物以窄带形式进样到含有固定化配体的微尺度亲和平台上，在促进结合的pH、溶液和温度条件下进行。通过测量分析物的保留时间（t_R）并与死时间（t_M）比较，计算出保留因子（k = (t_R- t_M)/t_M）。在进样量小且处于线性洗脱条件下，特定保留因子（k'）与固定化配体上活性位点的摩尔数（m_L）以及分析物与配体的结合常数（K_a）相关（k' = K_am_L/V_M，其中V_M为柱死体积）。

区带分析已广泛应用于研究竞争与置换效应。例如，通过将探针化合物进样到含有竞争剂的流动相中，观察探针保留行为随竞争剂浓度的变化，可以判断它们是否共享结合位点或存在变构效应。此方法已用于研究抗糖尿病药物与人血清白蛋白（HSA，包括糖化修饰的HSA）的结合、环境污染物与腐殖酸的相互作用、药物与α₁-酸性糖蛋白（AGP）的结合立体选择性，以及药物与高/低/极低密度脂蛋白（HDL/LDL/VLDL）的相互作用等。

对于非线性条件，可采用进样量依赖法或峰拟合方法（如使用包含修正贝塞尔函数的方程拟合峰形）来获取结合动力学参数（k_a, k_d）。这些方法已用于研究药物与β₂-肾上腺素能受体、内皮素受体A、电压依赖性阴离子通道1（VDAC-1）等多种靶点的相互作用动力学。

4 微尺度亲和色谱中的前沿分析

前沿分析是μAC中另一种获取生物相互作用信息的重要技术。该方法将含有已知浓度目标分析物的溶液连续上样到亲和柱上。随着结合位点逐渐饱和，过量的分析物会形成突破曲线。通过在不同浓度下测量突破曲线的中心位置，并拟合相应的结合等温线方程（例如，对于1:1快速平衡系统，m_L,app= (K_a[A]m_L)/(1 + K_a[A])，其中m_L,app是达到突破曲线中心点所需分析物的摩尔数，m_L是柱上配体总位点数），可以确定结合常数（K_a）和结合位点数（m_L）。

前沿分析已成功应用于研究多种系统，如抗糖尿病药物与正常或糖化HSA的结合、5-羟色胺1A受体与其配体的相互作用、以及药物与脂蛋白结合的立体选择性。阶梯式前沿分析通过连续施加不同浓度的分析物溶液（中间无需清洗步骤），形成阶梯状的突破曲线，大大提高了分析效率，已用于研究地高辛、华法林与HSA的结合，以及坦索罗辛、维拉帕米与AGP的相互作用。

前沿亲和色谱-质谱联用（FAC-MS）是前沿分析与质谱检测结合的强大平台，可用于筛选化合物库与固定化靶标（如蛋白激酶C、二氢叶酸还原酶）的相互作用，以及研究碳水化合物-凝集素相互作用等。

5 微尺度亲和色谱中的动力学方法

μAC提供了多种研究生物相互作用动力学的工具。

• •
  板高法/峰形分析法：通过分析不同流速下分析物色谱峰的展宽（板高H），分离出由固定相传质（H_s）引起的展宽贡献。H_s与解离速率常数（k_d）和线性流速（u）有关（H_s= [2uk/(1+k)²] × [k_d/(k_a[L] + k_d)²]）。通过绘制H_s与u/(1+k)²的关系图，可从斜率求得k_d。此法适用于具有中等至强结合力（K_a≤ 10⁶M^-1）和较快动力学（k_d约10^-2至10^-1s^-1）的系统。
• •
  分流峰法：在高流速或小柱体积条件下，部分分析物可能来不及与固定化配体结合而直接流出色谱柱，导致色谱峰分裂。未保留分数（F）与结合速率常数（k_a）等因素相关。通过研究F与流速的关系，可以估算k_a。此法特别适用于结合较强、解离较慢的系统。
• •
  峰衰减法：在促进解离（如使用竞争剂或饱和进样以减少重结合）的条件下，监测被固定化配体捕获的分析物的洗脱衰减曲线。衰减曲线的斜率与解离速率常数（k_d）直接相关（ln[分析物响应] ∝ -k_dt）。此法适用于研究具有中等至弱结合力的系统，也可用于优化强结合系统的洗脱条件。

这些动力学方法已广泛应用于测量药物与血清蛋白（如HSA、AGP）、免疫球蛋白与蛋白A/G、激素与其受体、以及小分子与环糊精等体系的结合和解离速率常数。

6 超快亲和萃取与微尺度亲和系统

超快亲和萃取（UAE）是μAC的一种特殊应用，用于直接测量样品中分析物与其可溶性结合剂相互作用后的游离分数。该方法将含有目标分析物及其结合剂的样品快速进样到一个含有次级捕获配体（如抗体、HSA等）的μAC柱上。柱子的尺寸和流速经过优化，使样品在柱内的停留时间极短（毫秒至秒级），从而最大限度地减少分析物从样品中可溶性结合剂上解离的程度。被次级配体捕获的分析物量即对应于样品中原始的游离分析物分数。

测得的游离分数（F_t）可用于估算分析物与可溶性结合剂的结合常数（K_a）和解离速率常数（k_d）。在高流速（短停留时间t）下，F_t接近平衡时的真实游离分数（F₀），进而通过结合等温线方程求算K_a。若在不同流速（不同t）下测量F_t，则可通过关系式ln[1/(1-F_t)] ≈ (k_dF₀/ (1-F₀))t 同时获取k_d和F₀。

UAE的优点包括样品需要量少、分析速度快、无需固定化待研究的原始结合对中的任一组分。它已成功用于研究药物（如华法林、磺酰脲类药物）与HSA（包括修饰HSA）的结合、激素（如睾酮）与血清蛋白（HSA、AGP、性激素结合球蛋白）的相互作用，以及多种药物与AGP的结合。

7 结语

μAC作为一种强大的技术，为定量表征生物相互作用的强度（结合常数）和动力学（速率常数）提供了多种灵活而高效的方法。区带分析和前沿分析适用于结合强度的测定和竞争结合研究；而板高法、分流峰法、峰衰减法和UAE等则主要用于动力学参数的获取。这些方法所需样品量少、分析速度快、易于自动化且可与多种检测技术联用，在药物发现、临床检测、环境监测和基础生物化学研究等领域展现出广阔的应用前景。随着技术的不断发展和完善，μAC有望在生物相互作用研究领域发挥越来越重要的作用。