新型温敏型穿梭载体pM4B522实现Shouchella clausii高效无标记基因组编辑的技术突破

《Microbial Biotechnology》：Development of a Tool for High-Efficiency, Markerless and Iterative Genome Editing in Shouchella clausii

本文报道了一种革命性的遗传操作工具，通过优化高渗电转 protocol 并设计温敏型大肠杆菌-梭氏梭菌穿梭载体 pM4B522，首次实现了对益生菌 Shouchella clausii 的高效、无标记、迭代式基因组编辑。该系统采用 Golden Gate 组装兼容的载体设计，通过两步法同源重组成功实现基因删除、异源基因插入和单碱基点突变，编辑成功率超60%，为下一代益生菌开发和合成生物学应用提供了关键技术支撑。

引言

Shouchella clausii（原名Bacillus clausii）是一种产孢、嗜碱的革兰氏阳性细菌，具有内在抗生素抗性，在生物治疗、工业生物技术和环境应用领域展现出巨大潜力。由于其难以进行遗传操作，限制了其作为微生物底盘的发展。本研究通过优化电转方案和开发新型穿梭载体，成功突破了其遗传转化瓶颈。

材料与方法

通过高渗电转方案结合细胞壁弱化剂（0.5%苏氨酸、0.05%吐温80和0.6%甘氨酸），在含有0.33M海藻糖、0.5M山梨醇和0.5M甘露醇的电转缓冲液中，实现了7×10³CFU/μg DNA的转化效率。核心工具pM4B522载体（6.9kb）包含温敏复制起点repA^ts、壮观霉素抗性基因（spec^r）、红色荧光蛋白报告基因（rfp）以及可移除的AmilCP蓝色筛选标记，支持Golden Gate一键式组装。

基因组编辑操作流程包括：30°C条件下质粒转化获得红色转化子→42°C高温筛选单交换整合子→无抗性培养基培养诱导二次重组→通过菌落PCR和表型筛选验证编辑结果。该系统成功应用于lacA（β-半乳糖苷酶）和xylA（木糖异构酶）的序列删除、gfp报告基因的精准插入以及lacA基因点突变引入。

结果验证

基因删除实验显示，ΔxylA突变体在木糖为唯一碳源的培养基中生长缺陷，而ΔlacA突变体在X-gal平板上呈现白色菌落且无法利用乳糖。将lacA编码序列替换为gfp后，在乳糖诱导下荧光强度提升约1.8倍。通过引入C→A点突变（Ser344→终止密码子），成功获得功能缺失的lacA< />突变株。该系统在Bacillus subtilis 168中同样有效，amyE基因删除株在淀粉水解实验中显示清晰表型。

讨论与展望

该研究突破了S. clausii遗传操作的三大技术壁垒：细胞壁厚导致的DNA摄取困难、天然感受态缺失以及缺乏稳定复制质粒。pM4B522系统相较于CRISPR/Cas9等编辑工具具有无疤痕、无外源基因残留、可循环使用等优势，符合FDA对活体生物治疗产品的监管要求。未来可通过启动子工程优化异源表达效率，开发基于孢子递送系统的口服生物治疗方案。

该技术平台为革兰氏阳性菌的遗传改造提供了通用解决方案，特别适用于需要多次基因编辑的合成生物学项目。结合S. clausii固有的抗生素兼容性和人类安全使用历史，该研究为下一代益生菌和活体生物治疗产品的开发奠定了关键技术基础。