《Molecular Plant Pathology》：CtTLP13 Located in Extracellular Vesicles Enhances the Resistance of Safflower (Carthamus tinctorius) to Botrytis cinerea
编辑推荐：
本研究首次通过全基因组关联分析(GWAS)在红花中鉴定出类甜蛋白(CtTLP13)的关键抗病基因，并创新性揭示其通过胞外囊泡(EVs)跨物种转运至病原菌的创新机制。多组学分析证实CtTLP13在转录组、蛋白组层面均响应灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染，体内外实验验证其通过破坏真菌细胞壁发挥抑菌作用。该研究为植物-病原菌互作提供了EVs介导蛋白转运的新视角，对红花抗病育种具有重要指导意义。
1 引言
红花(Carthamus tinctorius)作为菊科兼具药用和油用的经济作物，在全球广泛栽培。然而在采收期易受真菌侵染导致品质下降，其抗病基因研究滞后制约了抗病育种进程。类甜蛋白(TLP)作为病程相关蛋白PR5家族成员，在植物抵御生物胁迫中发挥关键作用，但其作用机制尚未完全阐明。胞外囊泡(EVs)作为新型生物大分子转运载体，在植物-微生物互作中展现出双向运输功能，为阐释抗病蛋白的跨膜转运机制提供了新思路。
2 结果
2.1 通过GWAS鉴定病程相关候选基因CtTLP13
对499份红花种质资源进行全基因组关联分析，发现位于染色体8的SNP位点Chr8_65303911与病害严重度指数显著相关(p=2.20e-07)。连锁不平衡分析显示该位点与TLP基因家族成员Chr8T0272400紧密连锁，经系统鉴定将其命名为CtTLP13。GO富集分析显示374个关联基因显著富集于"应答刺激""防御反应"等生物学过程。
2.2 红花响应灰葡萄孢侵染的转录组与蛋白组分析
灰葡萄孢侵染红花叶片后，转录组在12/24/48/72小时分别检测到2724/2486/2950/3985个差异表达基因。WGCNA分析显示棕色模块(670个基因)与病原菌处理呈显著正相关，其中CtTLP13作为枢纽基因与PR1、几丁质酶等抗病基因共表达。蛋白组在48/72小时分别鉴定到603/932个差异表达蛋白，蓝模块(948个成员)显著富集于应激响应通路。多组学联合验证CtTLP13在转录和蛋白水平均显著上调。
2.3 CtTLP13过表达增强植物抗病性
构建pCAMBIA1302-p35S::CtTLP13-GFP过表达载体，在拟南芥和红花中异源表达CtTLP13。接种实验表明转基因植株对灰葡萄孢抗性显著增强，共聚焦显微镜观察发现CtTLP13-GFP融合蛋白在病健交界处大量积累，提示其可能通过胞外分泌参与防御反应。
2.4 CtTLP13定位于EVs且红花EVs具抑菌活性
亚细胞定位显示CtTLP13分布于细胞膜和质外体空间。从红花叶片分离的EVs经透射电镜确认呈碟形双层膜结构，纳米粒径追踪分析显示主要分布于80-150纳米。免疫荧光共定位(FM4-64标记膜结构)和Western blot验证CtTLP13存在于EVs内部。抑菌实验表明红花EVs可被灰葡萄孢孢子内化，并显著抑制菌丝发育和孢子萌发，过表达CtTLP13的EVs抑菌活性更强。
2.5 CtTLP13体外抑制灰葡萄孢活性
原核表达纯化CtTLP13蛋白，牛津杯法证实其呈现剂量依赖性抑菌效应，100微克蛋白抑菌圈直径最大。孢子萌发实验显示CtTLP13处理组24小时萌发率为0%，显著低于对照组(>90%)，证明其直接破坏真菌细胞壁功能。
3 讨论
本研究通过多组学整合分析系统阐释了红花抗病机制：GWAS鉴定的CtTLP13在病原侵染时通过EVs介导的跨物种转运进入真菌细胞，协同几丁质酶等抗病蛋白破坏病原菌细胞壁。该发现不仅为植物免疫研究提供了EVs介导蛋白转运的新范式，也为红花抗病育种提供了重要靶基因。后续研究可深入解析EVs载体的特异性标志蛋白及其与其它PR蛋白的协同作用机制。
4 实验方法
实验采用红花品种"安徽-1"，通过真空渗透法提取质外体洗涤液，差速离心结合EXODUS系统纯化EVs。转基因通过农杆菌介导的花序浸染法实现，蛋白互作采用酵母双杂交和Co-IP验证，统计学分析使用GraphPad Prism 9.5完成。
