《Plant Science》：VvTPS14 Is a Linalool Synthase Activated by VvbZIP3 and Repressed by VvMADS4
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葡萄Linalool合成酶VvTPS14的转录调控机制研究
聂子叶|王晓晨|刘贤菊|王毅|张婷婷|梁振昌|范佩格
中国科学院植物研究所植物多样性与特色作物国家重点实验室及葡萄科学与酿酒学北京重点实验室，北京100093，中国
摘要
芳樟醇是一种关键的芳香萜类化合物，赋予葡萄果实特有的麝香风味。然而，调控其生物合成的上游转录机制仍很大程度上未知。本研究通过GC-MS和转录组分析，发现在麝香葡萄和非麝香葡萄品种的果实发育过程中，VvTPS14基因的表达与芳樟醇的积累模式密切相关。功能分析证实，VvTPS14-2编码一种位于叶绿体中的酶，在体外条件下能催化芳樟醇从GPP（香叶基丙酮磷酸）的合成。在Nicotiana benthamiana叶片、葡萄果实和Vitis amurensis愈伤组织中瞬时和稳定过表达VvTPS14-2均显著增强了芳樟醇的产生，从而确定VvTPS14为关键的芳樟醇合成酶。通过酵母单杂交筛选，阐明了VvTPS14的上游调控机制，发现VvbZIP3和VvMADS4是VvTPS14启动子的直接结合因子。双荧光素酶实验表明，VvbZIP3-4（一种剪接变异体）能够激活VvTPS14的表达，而VvMADS4则抑制其表达。这种调控模式在异源和同源系统中均得到验证。这些发现揭示了控制芳樟醇生物合成的完整转录调控模块，并为葡萄风味的分子育种提供了潜在靶点。
引言
香气对葡萄的质量和市场价值至关重要，直接影响消费者对果肉及其衍生产品的偏好（Chen等人，2024年）。挥发性化合物的组成将葡萄香气分为三大类：草莓香、麝香香和中性香（Wu等人，2019年）。其中，麝香香葡萄品种因其独特的玫瑰香味而备受青睐，这种香味主要来源于芳樟醇、玫瑰氧化物、α-萜品醇、香叶醇和橙花醇等单萜类化合物。大量证据表明，芳樟醇是赋予葡萄独特玫瑰香味的主要挥发性成分。芳樟醇的浓度直接决定了花香特征的强度和质量（Wu等人，2019年；Longo等人，2021年；Liu等人，2024年）。值得注意的是，芳樟醇的生物合成作用不仅限于葡萄，它在桃子和茶树等多种水果作物中也起着重要作用，同样能增强其花香（Zhou等人，2020年；Li等人，2023年；Cao等人，2024年）。这种广泛的功能重要性和显著的感觉效应使芳樟醇成为全球水果香气研究的热点。迄今为止，已在葡萄果实和葡萄酒中鉴定出70多种萜类化合物，其中芳樟醇因其在定义理想麝香香特征中的关键作用以及作为风味育种目标的重要性而受到最广泛的研究（Marais，1983年；Sasaki等人，2016年）。
在葡萄中，单萜类化合物的生物合成通过质体中的甲基赤藓糖磷酸（MEP）途径进行（Alicandri等人，2020年）。该途径始于丙酮酸和甘油醛-3-磷酸（G3P）的缩合，这一反应由限速酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶（DXS）和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶（DXR）催化生成MEP。随后的一系列酶促反应将MEP转化为基本的五碳单元异戊二烯基二磷酸（IPP）和二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）。香叶基二磷酸合成酶（GPPS）将IPP和DMAPP分别转化为香叶基二磷酸（GPP），后者是单萜类化合物的前体。最后，萜类合成酶（TPSs）将GPP转化为多种具有香味的单萜类化合物（Lin等人，2019年；Alicandri等人，2020年）（图1）。在这些酶中，TPS家族催化该途径的最终步骤，决定了葡萄中单萜类化合物的组成（Wang等人，2011年；Dalla Costa等人，2018年）。
许多萜类合成酶（TPS）基因决定了水果（尤其是葡萄）的麝香香气。然而，这些基因的功能特异性及其时空调控机制仍不甚明了。不同植物中的TPS基因家族通常包含30到100多个成员（Celedon，Bohlmann，2019年）。在葡萄（Vitis vinifera L）中，基于隐马尔可夫模型（HMM）的筛选鉴定出24种单萜类合成酶（mono-TPSs）（Priya等人，2018年）。其中8种合成酶——1种属于TPS-b亚家族，7种属于TPS-g亚家族——与芳樟醇的生物合成相关。通过在大肠杆菌（Escherichia coli）中的异源过表达实验，证实了其中几种候选基因具有芳樟醇合成活性（Martin等人，2010年；Zhu等人，2014年）。此外，VvPNLGl1、VvPNLGl2和VvPNLGAl4的转录水平与‘Muscat Hamburg’葡萄果实中的芳樟醇积累量相关（Yue等人，2020年）。这些基因表现出不同的时空表达模式。例如，VvRILinNer在果实早期发育过程中在果皮、果肉和种子中的表达量与芳樟醇的积累同步（Zhu等人，2014年），而VvTPS14（也称为VvPNLinNer1）主要在果实成熟期表达（Sasaki等人，2016年；Zhang等人，2017年）。在Nicotiana benthamiana中瞬时过表达VvTPS56显著增强了芳樟醇的产生（Wang等人，2021年），进一步证明了葡萄TPS酶的功能多样性。除了葡萄，其他物种中的芳樟醇生物合成机制也有部分研究，但比较功能和调控机制仍较为有限。在桃子中，PpTPS1和PpTPS3参与了芳樟醇的形成（Wei等人，2022年；Wei等人，2025年）；在甜橙中，CitTPS16被鉴定为催化E-香叶醇（一种对柑橘香气至关重要的单萜醇）生物合成的关键酶（Li等人，2017年）。此外，最近的一项关于荔枝的研究发现，串联重复的TPS基因簇（LcTPSa1-LcTPSa4）对倍半萜类香气的多样性有贡献，这些基因的变异影响了酶活性和调控因子的结合亲和力（Hu等人，2025年）。这种在发育调控、基因家族组成和酶特异性方面的差异反映了不同物种间香气生物合成机制的进化多样性。
葡萄中的萜类化合物生物合成受到多个家族转录因子（TFs）的调控，包括WRKY、ERF、MADS-box和ARF。VviWRKY40抑制参与单萜类化合物糖基化的糖基转移酶VviGT14。脱落酸（ABA）处理降低了VviWRKY40的表达，同时上调了VviGT14的表达，表明VviWRKY40在ABA信号调控下的糖基化单萜类化合物生物合成中处于下游位置（Li等人，2020年）。AP2/ERF转录因子VviERF003与VviGT14启动子结合并增强了其活性，这一点通过酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶报告基因（DLR）实验得到证实。在葡萄叶片、果皮和愈伤组织中过表达VviERF003显著提高了VviGT14的转录水平并增加了糖基化萜类化合物的含量。此外，乙烯处理同时影响了VviERF003和VviGT14，进一步促进了糖基化萜类化合物的生物合成（Wang等人，2024年）。转录组和代谢物分析表明，外源油菜素内酯（EBR）和茉莉酸（JA）处理显著上调了萜类途径中的关键结构基因（如VvDXS、VvDXR和VvHDRVvCCD4b的活性（Meng等人，2020年）。尽管取得了这些进展，但控制芳樟醇（一种主要的玫瑰香味化合物）生物合成的关键酶基因和转录调控机制仍不清楚，需要系统研究。
本研究通过综合分析不同果实发育阶段的萜类化合物和转录组谱型，鉴定出VvTPS14为葡萄中的潜在芳樟醇合成酶。功能分析证实了VvTPS14在芳樟醇生成中的酶促作用，并筛选出10个调控其表达的候选转录因子。后续验证表明，VvbZIP3直接激活VvTPS14的表达，而VvMADS4则抑制其表达，从而确定了控制单萜类化合物生物合成的核心转录调控模块。这些发现为理解香气形成机制提供了机制框架，并为葡萄的风味育种提供了战略靶点。
材料与生长条件
转录组测序使用了来自麝香葡萄品种‘Jingxiangyu’（V. vinifera）、‘Muscat Hamburg’（V. vinifera）、‘97-3-34’（V. vinifera）以及非麝香葡萄品种‘Jingcui’（V. vinifera）、‘Cabernet Sauvignon’（V. vinifera）和‘Chardonnay’（V. vinifera）的多个发育阶段的果实样本。每个样本均进行了三次独立重复实验。麝香葡萄品种‘97-3-34’的成熟果实用于基因克隆。
葡萄中的芳樟醇含量与VvTPS14转录水平相关
对三个发育阶段（豌豆大小期、转色期和收获期）的葡萄进行综合挥发性萜类化合物和转录组分析，发现麝香葡萄和非麝香葡萄品种之间存在明显的积累差异。萜类化合物主要在麝香葡萄果实中积累，且从转色期开始浓度显著增加（表A.1）。在八种主要单萜类化合物中（图2A），芳樟醇是最丰富的萜类化合物，在成熟果实中的含量达到峰值
VvTPS14是负责葡萄果实中芳樟醇生物合成的功能性单萜类合成酶
葡萄果实中的萜类化合物生物合成受到遗传和环境因素的复杂相互作用调控（Wilson等人，1984年；Yang等人，2009年；Wen等人，2015年；Liu等人，2022年）。在这一代谢过程中，单萜类化合物在定义品种特异性香气方面起着关键作用。芳樟醇是赋予麝香葡萄独特玫瑰香味的主要成分，直接影响果实质量和消费者偏好（Sasaki等人，2016年；Liu等人，
结论
芳樟醇是麝香葡萄成熟果实中独特玫瑰香味的主要单萜类化合物。本研究确定VvTPS14为葡萄中芳樟醇生物合成的关键酶，并通过功能验证证实了其催化作用。此外，两个转录因子VvbZIP3和VvMADS4分别作为激活因子和抑制因子，精细调节VvTPS14的表达和芳樟醇的积累。这些结果
资金来源
本研究得到了中国自然科学基金（U23A20205）的支持。
CRediT作者贡献声明
聂子叶：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、概念构建。王晓晨：结果验证、实验研究。刘贤菊：结果验证、数据管理。张婷婷：结果验证。王毅：资源提供、数据分析。梁振昌：项目监督、资源获取、资金筹集。范佩格：写作——审稿与编辑、项目监督、资源提供、资金筹集、概念构建。
