水稻IPA1-NRT1.1B调控模块通过调节活性氧稳态赋予镉耐受性的分子机制解析

《Plant Stress》：The IPA1–NRT1.1B regulatory module regulates ROS homeostasis to confer cadmium tolerance in rice

为解决水稻镉(Cd)污染威胁粮食安全和人体健康的问题，研究人员围绕IPA1、NRT1.1B和SAPK6基因模块，开展了其在镉胁迫响应中分子机制的探索。研究发现，IPA1能直接结合并激活NRT1.1B的转录，而OsSAPK6通过对IPA1关键磷酸化位点(S201和S213)的修饰，精细调控此转录激活过程，最终通过维持活性氧(ROS)稳态来增强水稻的镉耐受性。该研究为培育高镉耐受性水稻新品种提供了新靶点与理论依据。

　　

镉(Cd)，一种银白色、有延展性的重金属，对生物体而言却是致命的“隐形杀手”。它不是植物生长所需的营养元素，却极易被水稻等农作物从污染土壤中吸收，并富集到可食用的籽粒中。长期食用镉超标的大米，会导致人体肾损伤、神经毒性甚至癌症。由于镉在人体内的生物半衰期可长达30年，其对健康的威胁持久而严峻。因此，如何降低水稻籽粒中的镉含量，培育耐受镉胁迫的水稻品种，已成为保障全球粮食安全、促进农业可持续发展的紧迫课题。水稻应对镉毒害的核心挑战之一，是镉会引发细胞内活性氧(ROS)的爆发性积累。过量的ROS，如超氧阴离子(O₂^-)和过氧化氢(H₂O₂)，会像失控的“自由基风暴”，攻击细胞膜脂质、蛋白质和DNA，导致氧化损伤，严重抑制植物生长。为了抵御这场风暴，植物进化出了精密的抗氧化防御系统（如SOD、CAT、POD等酶）和调控网络。此前的研究表明，一个名为理想株型1号（Ideal Plant Architecture 1, IPA1，亦称SPL14）的转录因子，不仅调控水稻株型和产量，还参与干旱等非生物胁迫响应，可能通过调节ROS清除相关基因来增强耐受性。另一个关键基因NRT1.1B（又称NPF6.5），主要功能是转运硝酸盐，与水稻氮素利用效率相关。在拟南芥中的研究提示，硝酸盐转运蛋白NRT1.1可能与镉的吸收存在关联，但其在水稻镉胁迫中的具体角色仍是未知数。此外，属于SnRK2家族的蛋白激酶OsSAPK6，是脱落酸(ABA)和胁迫信号通路的关键组分，可磷酸化下游靶蛋白以传递胁迫信号。这三者之间是否存在联系，又如何共同调控水稻的镉耐受性？这构成了本研究的核心科学问题。该研究论文发表在《Plant Stress》期刊上。

为探索上述问题，研究人员综合运用了多种关键技术。在材料构建上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在水稻品种FH7185和ZH11中分别创建了ipa1、nrt1.1b和Ossapk6的基因敲除突变体。在分子互作验证方面，通过酵母单杂交(Y1H)和电泳迁移率变动分析(EMSA)证明了IPA1蛋白能直接结合NRT1.1B基因的启动子；利用双荧光素酶报告基因(Dual-LUC)实验在原生质体中验证了IPA1对NRT1.1B的转录激活作用。在生理与生化分析上，采用二氨基联苯胺(DAB)和氮蓝四唑(NBT)组织化学染色法检测H₂O₂和O₂^-的积累，并测定了丙二醛(MDA)含量以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)的活性来评估氧化损伤程度。在转录组学分析上，对Cd处理后的ipa1突变体进行了RNA测序(RNA-seq)，以全基因组范围筛选IPA1调控的下游靶基因。在元素分析上，使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定了水稻根和地上部的镉含量。

3.1. IPA1通过调节ROS正向调控水稻的镉耐受性

研究人员首先发现，镉处理能显著抑制IPA1基因的表达。与野生型相比，ipa1突变体在镉胁迫下表现出更严重的生长抑制。关键的是，ipa1突变体在镉处理后，其根和地上部积累了显著更多的镉元素。生理检测显示，ipa1突变体叶片中H₂O₂和O₂^-的积累更强，MDA含量更高，而CAT和POD的活性更低，表明其氧化损伤更为严重。对一系列ROS清除基因（如Cu/Zn-SOD、OsCATB、OsAPXs等）和镉转运基因（如OsNRAMP1、OsNRAMP5、OsHMA2等）的时序表达分析发现，在ipa1突变体中，许多抗氧化基因在早期（0-12小时）被显著诱导，但随后下降，而多个镉转运基因的表达模式也发生紊乱。这些结果综合表明，IPA1通过调节ROS稳态和镉转运相关基因的表达，在水稻镉耐受性中发挥正向调控作用。

3.2. IPA1在镉胁迫下通过结合启动子和转录激活直接调控NRT1.1B

为了寻找IPA1的下游靶标，研究者对Cd处理的ipa1突变体进行了RNA-seq分析。基因本体(GO)富集分析将硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B鉴定为差异表达基因，它富集在“对含氧化合物的响应”条目中。表达分析显示，在镉胁迫下，野生型中NRT1.1B的表达迅速升高，而在ipa1突变体中其表达水平总体较低。随后的分子实验提供了确凿证据：酵母单杂交和EMSA实验证明IPA1蛋白能直接结合NRT1.1B的启动子序列；双荧光素酶报告基因实验进一步证实，IPA1能显著增强NRT1.1B启动子的活性。qRT-PCR结果也验证NRT1.1B在ipa1突变体中的表达量低于野生型。这些发现清晰地揭示了IPA1作为转录因子，直接激活下游靶基因NRT1.1B表达的分子途径。

3.3. NRT1.1B通过调节ROS正向调控镉耐受性

接下来，研究探讨了NRT1.1B本身在镉胁迫中的作用。研究表明，镉处理能诱导NRT1.1B的表达。与ipa1类似，nrt1.1b突变体对镉胁迫表现得更敏感，出现叶片卷曲和生长抑制，并且在根和地上部积累了更多的镉。组织化学染色显示，nrt1.1b突变体叶片在镉胁迫后H₂O₂和O₂^-积累更显著，同时伴有MDA含量上升和CAT、POD活性下降。对抗氧化基因和镉转运基因的时序表达谱分析揭示，NRT1.1B的缺失同样扰乱了多个ROS清除基因（如胞质/质体Cu/Zn-SOD、OsPOD、OsAPXs等）和镉转运基因（如OsNRAMP5、OsHMA3、OsIRT1等）的协调表达。这些数据表明，NRT1.1B是镉胁迫响应的正调控因子，其功能缺失导致ROS清除系统紊乱和镉转运失衡，从而加剧氧化损伤。

3.4. OsSAPK6介导的IPA1磷酸化对其转录激活功能至关重要

已有的研究表明OsSAPK6能磷酸化IPA1。本研究发现，将IPA1蛋白的两个关键磷酸化位点S201和S213分别突变为丙氨酸（S201A和S213A）后，突变体蛋白与NRT1.1B启动子探针的结合能力显著减弱。双荧光素酶报告实验也证实，这些磷酸化位点的突变削弱了IPA1对NRT1.1B的转录激活能力。这说明OsSAPK6可能通过磷酸化IPA1的S201和S213位点，来精细调控其对下游靶基因的激活。

3.5. OsSAPK6参与镉耐受性

研究发现OsSAPK6基因的表达受镉诱导。表型分析显示，Ossapk6突变体对镉胁迫更敏感，镉积累量（尤其是根中）更高，并且表现出更强的ROS积累、更高的MDA含量以及更低的抗氧化酶活性。基因表达谱分析表明，OsSAPK6的缺失影响了众多ROS清除基因和镉转运基因的转录动态。这些结果证明OsSAPK6同样通过调节ROS稳态和镉相关基因表达，在水稻镉耐受性中发挥积极作用。

基于以上结果，研究提出了一个完整的工作模型：在镉胁迫下，激酶OsSAPK6被激活，进而磷酸化转录因子IPA1的S201和S213位点。这种磷酸化修饰会减弱IPA1与NRT1.1B启动子的结合及其转录激活能力，从而下调NRT1.1B的表达。NRT1.1B表达的降低破坏了ROS稳态，导致ROS过量积累，使得植株对镉毒害更加敏感。而在非胁迫或磷酸化水平较低时，IPA1能有效激活NRT1.1B，通过维持ROS平衡来增强镉耐受性。这揭示了OsSAPK6-IPA1-NRT1.1B模块通过整合转录调控和翻译后磷酸化修饰，来协同调控ROS稳态，从而决定水稻镉耐受性的新机制。

综上所述，本研究系统阐明了水稻响应镉胁迫的一个新颖调控模块。研究结论指出，转录因子IPA1能直接结合并激活硝酸盐转运蛋白基因NRT1.1B的转录，从而正向调控水稻的镉耐受性，这一过程主要通过对活性氧(ROS)稳态的调控来实现。而激酶OsSAPK6则通过磷酸化IPA1蛋白的关键位点（S201和S213），对上述转录激活过程进行负向微调。ipa1、nrt1.1b和Ossapk6三种突变体均表现出对镉胁迫的超敏感性、更高的镉积累以及更严重的氧化损伤，从遗传学上验证了该通路的核心作用。在讨论部分，作者强调了该发现的创新性：首次将已知与株型、氮利用相关的IPA1和NRT1.1B纳入镉胁迫响应网络，并揭示了其通过调控ROS稳态发挥作用；阐明了OsSAPK6介导的磷酸化如何作为“分子开关”，精细调控IPA1的转录活性，这为理解胁迫信号从激感知到转录输出的级联过程提供了新视角。该研究不仅深化了对植物重金属胁迫应答分子机制的理解，更重要的是，IPA1、NRT1.1B和SAPK6作为关键调控节点，为通过分子设计育种或基因编辑技术，培育镉积累低、耐受性强的绿色安全水稻新品种提供了宝贵的候选基因和理论框架，对保障粮食安全和人体健康具有重要的科学意义与应用潜力。