在微囊藻毒素-LR的作用下，监测细胞和生物体内过氧化氢水平的升高情况

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Monitoring the upregulated hydrogen peroxide levels in cells and living organisms under the microcystin-LR exposure

氧化应激相关研究及近红外探针DSP-B开发用于MC-LR毒性检测，该探针特异性检测H2O2水平并成功应用于细胞、斑马鱼及鲇鱼模型中组织成像，揭示MC-LR诱导的氧化损伤机制。

　　

李炳燕|王昭敏|传慧燕|谢萍|刘勇

教育部植被结构、功能与构建国家重点实验室，中国西南地区跨界生态安全关键实验室

摘要

在蓝藻水华期间，微囊藻毒素-LR（MC-LR）会大量释放到水环境中，对植物、动物乃至人类的健康构成威胁。大量证据表明，MC-LR的毒性与其引发的氧化应激之间存在密切关联。过氧化氢（H?O?）是活性氧（ROS）的主要成分之一，在氧化应激条件下容易过量产生。因此，检测暴露于MC-LR的生物体内H?O?水平的变化可以作为MC-LR诱导的氧化损伤的指标。然而，直接检测暴露于MC-LR的生物体内H?O?水平的相关研究尚缺乏。在本研究中，我们开发了一种新型近红外探针DSP-B，用于检测生物体在MC-LR诱导的氧化应激下的H?O?水平。DSP-B对H?O?具有高灵敏度和特异性，其检测内源性和外源性H?O?的能力也得到了验证。随后，我们利用DSP-B检测了经MC-LR处理的细胞和斑马鱼体内的H?O?水平，以阐明MC-LR引起的氧化应激效应。此外，DSP-B还被用于MC-LR中毒的鲶鱼组织的可视化成像，成功观察到了H?O?水平的升高。本研究为分析MC-LR诱导的氧化应激提供了一种新策略，并展示了该探针在MC-LR毒性研究中的潜力。该探针有望为评估环境中生物体暴露于MC-LR的风险和危害提供帮助。

引言

过去几十年中，有害的蓝藻水华频繁发生，已成为一个突出的环境问题[1]、[2]、[3]。蓝藻的增殖和大量积累会降低水质，破坏水生生态系统功能，并对动物和人类健康构成严重威胁。蓝藻能够产生并释放高毒性的天然化合物，其中微囊藻毒素是最具代表性的。微囊藻毒素-LR（MC-LR）是蓝藻释放的最危险的毒素之一。全球许多富营养化水体中都检测到了MC-LR[4]、[5]。鉴于MC-LR的广泛分布，关于其对生态系统和生物体威胁的研究正在不断增加[6]、[7]。大量证据表明，MC-LR会在多种器官中积累并造成病理损伤[8]、[9]。除了多器官毒性外，亚急性和急性暴露于MC-LR还会扰乱动物的内分泌系统，导致脂质代谢紊乱和其他生理问题[10]、[11]、[12]、[13]。MC-LR甚至可以穿过血脑屏障，激活相关信号通路并诱导神经细胞的炎症反应[14]、[15]、[16]、[17]。此外，MC-LR在哺乳动物中的致死剂量低于在水生动物中的致死剂量[18]。因此，研究生物体暴露于MC-LR的相关风险至关重要。

氧化应激被认为是MC-LR影响生物体的关键有害机制，它对细胞损伤、凋亡及由此引发的疾病的发生起着关键作用[19]、[20]、[21]。过氧化氢（H?O?）是评估氧化应激的重要生物标志物之一[22]、[23]。当生物体暴露于应激源时，体内会过量产生活性氧（ROS），从而导致氧化损伤。与其他ROS相比，H?O?具有许多优势，包括在体内广泛分布、相对较低的反应性，以及在生理条件下能够达到相对稳定且可检测的水平[24]、[25]。此外，H?O?还被认为参与多种生理和病理过程[26]、[27]、[28]、[29]。多项研究表明，在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病的发展过程中，H?O?的异常产生起着重要作用[30]、[31]。有趣的是，作为一种强效的肝癌促进因子，MC-LR还能在动物体内诱导神经毒性，导致与神经退行性疾病相关的症状，如运动迟缓、记忆缺陷和学习障碍[32]、[33]、[34]。因此，我们认为MC-LR的多种毒性可能与体内的H?O?水平有关，H?O?可以作为评估生物体在MC-LR暴露下氧化损伤的生物标志物。

乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的水平是检测MC-LR压力下细胞和生物体损伤的最常用指标[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。然而，目前检测这些指标的方法需要先对动物实施安乐死，然后进行组织分离和匀浆处理，最后使用特定的检测试剂盒进行分析。这一过程操作繁琐且需要牺牲动物，无法在体内直接进行检测。此外，目前还缺乏能够直接可视化MC-LR暴露后生物体内氧化应激水平的工具。荧光探针技术由于其高灵敏度、高选择性和非破坏性样品处理能力，在原位检测领域得到了广泛应用[40]、[41]、[42]、[43]。例如，2023年，Lin等人使用BSZ-H?S探针研究了植物根系对盐分和干旱等外部环境变化的响应[44]。2024年，Xie等人使用HBTM-HP探针对受农药处理的稻根和斑马鱼进行成像，分析了农药暴露引起的生物过程变化[45]。鉴于MC-LR可以引发氧化应激，构建一种用于检测MC-LR引起的H?O?变化的探针是可行的。利用荧光探针监测MC-LR暴露下生物体内的H?O?水平变化，可以快速在原位观察氧化状态的波动。这种新方法有望为深入研究MC-LR的发病机制提供新的解决方案。

在本研究中，基于苯硼酸酯对H?O?的高反应性，设计了一种针对线粒体的近红外（NIR）探针DSP-B，用于检测暴露于MC-LR压力下的生物体内H?O?水平的变化。线粒体是细胞中产生H?O?的主要细胞器。DSP-B的阳离子电荷可以与线粒体膜上的负电荷结合，使DSP-B能够直接检测线粒体周围的H?O?。反应后，苯硼酸酯作为离去基团会被去除。由于分子内电荷转移（ICT）的特性，DSP-B可以作为“开启”探针，通过荧光增强特异性识别H?O?（图1）[46]。探针的近红外特性使其荧光信号能够有效穿透组织样本，准确检测生物样本中的H?O?水平[47]。DSP-B成功应用于检测MC-LR孵育后的细胞内H?O?水平，并进一步对暴露于MC-LR的斑马鱼和鲶鱼进行了成像。监测暴露于MC-LR的生物体内H?O?水平的变化有助于阐明MC-LR毒性涉及的细胞信号传导过程和病理机制。本研究展示了使用荧光探针研究MC-LR对小分子活性的影响的创新方法。

DSP-B的合成

Cy7-Cl和DSP-OH的合成的具体方法见支持信息。

DSP-B的合成：将DSP-OH（135 mg，0.25 mM）和K?CO?（520 mg，4 mM）加入15 mL干燥的MeCN中，混合物在0°C下缓慢搅拌半小时。然后加入4-(溴甲基)苯硼酸 pinacol 酯（200 mg，0.75 mM），混合物在70°C下搅拌过夜。反应物用乙酸乙酯萃取，用Na?SO?干燥，并在真空条件下蒸发。得到粗产物后...

DSP-B的合成及其对H?O?的光谱分析

DSP-B按照方案1中的路线逐步合成。首先测量了DSP-B在各种溶剂中的吸收和荧光光谱。这种新化合物表现出较大的斯托克斯位移和优异的近红外光谱特性，表明其适用于生物成像应用（图S1）。随后进行了DSP-B对PBS中H?O?的滴定实验。在无H?O?的情况下，DSP-B在650 nm处显示吸收峰。随着H?O?的增加...

结论

在本研究中，我们构建了一种NIR探针DSP-B，用于检测MC-LR诱导的氧化应激下的H?O?。该探针通过引入苯硼酸 pinacol 酯基团进行了合理设计，使其对H?O?具有高选择性。DSP-B成功应用于检测暴露于MC-LR的细胞和斑马鱼中H?O?水平的升高。此外，我们还观察了MC-LR中毒的鲶鱼器官中H?O?水平的变化。这些结果...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了云南省科学技术厅与云南大学的双一流联合项目“翻译”（202401BF070001-004）和云南省星电人才支持计划青年人才项目的资助。此外，本研究还得到了云南大学研究生研究与创新基金（KC-24248493）和云南省教育厅科学研究基金项目（2026J1049）的支持。