《Talanta》：Development of Human IgG-Conjugated Heteroatom-Doped Carbon Quantum Dot Fluorescent Nanobioprobes for Smartphone-Enabled Sensitive and Quantitative Immunodiagnostics
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荧光碳量子点结合抗体纳米探针用于快速检测病原体抗原或抗体，通过植物来源的杂原子掺杂CQDs共价连接人/ goat IgG抗体，实现高灵敏度（LOD 2.65 ng）和稳定荧光信号检测。智能手机辅助分析验证了0.01-0.1 mg/mL检测范围及2.14%的荧光稳定性，为可持续POCT诊断提供新方案。
作者：Shreaya Das、Vishal Kansay、Shreyasi Athalye、Naveen Khargekar、Sasanka Chakrabarti、Milan Kumar Bera、Anindita Banerjee
印度马哈拉施特拉邦孟买King Edward Memorial医院ICMR-国家免疫血液学研究所输血传播疾病部门（邮编400012）
摘要
通过即时检测（POCT）快速、灵敏地检测病原体特异性抗原或抗体对于有效诊断和监测传染病至关重要。本研究报道了一种新型荧光纳米探针的开发，该探针利用绿色合成的掺杂杂原子（N、K、Ca）的碳量子点（CQDs）与人类/山羊IgG抗体共价结合。胺基和羧基功能化的CQDs是从Cissus quadrangularis提取物中通过水热法合成的，并通过高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）、X射线光电子能谱（XPS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、核磁共振（NMR）、紫外-可见光谱（UV-Vis）和荧光光谱进行了全面表征。胺基功能化的CQDs在466纳米波长下的荧光强度提高了约1.9倍，这归因于氮原子诱导的电荷稳定作用以及丰富的表面官能团。与传统羧基-CQD/胺基-IgG系统不同，本研究中的胺基-CQDs/羧基-IgG纳米探针在0.2毫克/毫升的IgG浓度下表现出最佳荧光性能。共价结合后的HR-TEM、FTIR和Zeta电位测试证实了IgG的稳定结合。cq-hCQDs-IgG(G/H)纳米探针的荧光响应随浓度（0.01-0.1毫克/毫升）的增加而增强。使用FMA和ELISA验证了共价结合后IgG的免疫反应性，显示出荧光响应的线性增加。对于针对人类IgG的F’ab抗体，检测限（LOD）为2.65纳克，定量限（LOQ）为8.85纳克。在UVA激发（365纳米）下，通过硝化纤维素膜上的点样分析评估了该纳米探针的灵敏度。智能手机辅助分析显示其线性检测范围为0.01-0.1毫克/毫升，LOD/LOQ值分别为22.7/68.8微克/毫升（人类）和28.5/86.4微克/毫升（山羊）。此外，cq-hCQDs-IgG(H)表现出良好的光稳定性，在60天后仅损失了2.14%的荧光强度；绿色评估也证实了CQDs及其生物 conjugates 的环境可持续性，从而凸显了cq-hCQDs-IgG纳米探针在免疫诊断中的潜力。
引言
病毒、细菌和真菌感染的全球出现和传播对公共卫生构成了重大且日益严重的威胁。有效的诊断、监测、研究以及应对这些感染的准备对于控制疫情至关重要[1],[2]。检测和量化病原体特异性抗原或抗原特异性免疫球蛋白/抗体是社区中传染病诊断和监测的关键策略[3],[4]。即时检测（POCT）能够在资源有限的环境中实现快速、可靠的诊断，帮助医疗专业人员及时做出明智的患者管理决策。随着POCT市场的快速增长和COVID-19诊断应用的推广，其在全球快速传染病检测中的关键作用日益凸显[5],[6],[7]。在POCT中，分析物通过抗体标记物发出的信号进行检测，常用的标记物包括酶、铁氰化物和胶体金等[8],[9],[10]。然而，这些传统标记物主要提供定性结果，缺乏提供精确定量信息的能力，而这对于准确诊断和有效监测传染病往往至关重要。因此，过去几十年的研究重点在于开发能够生成可量化信号的标记策略，以提高临床应用效果。
荧光纳米材料的最新进展促进了具有更高灵敏度和检测效率的先进传感器的设计[11]。通过将荧光纳米材料与特定的生物识别元件结合，荧光生物传感器因能够快速、可靠地检测病原体而受到广泛关注。在这方面，碳量子点（CQDs）作为一种零维纳米材料，因其优异的性能（如丰富的表面化学性质、生物相容性、低毒性、水溶性以及强的光致发光能力）而成为有前景的荧光纳米材料[12],[13]。与由镉、镓或铅等无机金属制成的传统量子点不同，CQDs无毒、稳定性高且可溶于水[14],[15]。此外，来自天然来源的CQDs还具有低毒性、化学稳定性、光稳定性、抗光漂白性、生物相容性、高效的光诱导电子转移以及高度可调的光致发光特性[16]。它们的发光光谱范围广泛，这主要受原材料和合成方法的影响。这些独特性质使CQDs成为诊断、基因治疗、药物递送和生物成像应用中的理想候选材料。此外，它们的环境友好性使其适合大规模生物医学测试[17]。CQDs与生物分子的天然兼容性，加上其可调的表面功能化，使其能够作为生物分子的有效载体或辅助剂[18]。此外，CQDs的荧光变化（如发射增强或淬灭）可以作为即时检测中的敏感指标[19]。尽管早期研究的Cd/Te/Zn基量子点具有出色的发光性能，但它们具有内在毒性。相比之下，掺杂杂原子的CQDs呈绿色且环保[20]。然而，有限的生物共价化研究阻碍了它们在定量即时免疫诊断中的应用。
市面上的POCT平台大多依赖定性标记物，而基于量子点的探针则使用有毒重金属，其荧光保留效果不佳且表征有限。此外，将绿色合成的碳量子点与基于抗体的传感技术和智能手机辅助的定量读数相结合的研究尚未得到充分探索。
本研究通过使用掺杂杂原子的植物来源CQDs开发了一种稳定的胺基-CQD/羧基-IgG纳米探针，填补了这一研究空白。所提出的策略结合了环保的合成方法、优化的抗体共价化技术、保持的免疫反应性以及与智能手机分析兼容的定量荧光检测，从而推动了可持续和定量的免疫诊断平台的发展。
材料、化学品和试剂
Cissus quadrangularis（俗称veldt葡萄）从大学校园采集（GPS坐标：30°24′ N, 77°04′ E）。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）（纯度≥97%）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）（纯度97%）、山羊血清中的IgG（纯度>95%）（I5256-50MG）、人血清中的IgG（纯度≥95%）（I4506-10MG）、抗人IgG（F’ab特异性）抗体（纯度>95%）（I5260-1ML）、乙二胺（EDA）（纯度99%）、己烷（纯度99.9%）、甲苯（纯度…
合成的cq-hCQDs的形态和组成特征
使用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）分析了合成的cq-hCQDs的形态和结构特征。低倍率TEM图像（图1a）显示CQDs分布均匀，无明显聚集现象。尺寸分布分析表明其平均粒径约为3.22纳米，符合诱导量子限制效应所需的纳米尺度。高分辨率TEM图像（图1b以及图S2a–c）进一步展示了明确的…
结论
总之，本研究报道了一种基于碳量子点（cq-hCQDs）的稳定纳米探针的开发，这些探针与人类IgG共价结合，形成了一个稳定的、具有免疫反应性的生物传感器，可用于高效定量分析物。定制的紫外室和安卓应用程序被用于建立荧光驱动的生物传感单元，将生成的荧光信号转换为实时定量数据。总体而言，这些结果证明了…
CRediT作者贡献声明
Naveen Khargekar博士：撰写、审稿与编辑、验证、软件开发、数据分析。Milan Bera博士：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法学设计、数据分析、概念构思。Sasanka Chakrabarti教授：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法学设计、数据分析。Shreaya Das博士：初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。Shreyasi Athalye：验证工作、项目管理
未引用的参考文献
[66]
伦理批准和参与同意
本研究无需伦理批准。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据可用性
数据可应要求提供给通讯作者。
致谢
作者感谢印度医学研究委员会（ICMR）为这项研究提供资金支持（项目编号：VIR/Intra/9/2023/CD(E-Office-170968）。同时感谢ICMR-NIIH TTD部门工作人员的支持。
