表观遗传失调是癌症的一个基本特征，异常的DNA和RNA甲基化模式已被认为是肿瘤发生和治疗抵抗的关键驱动因素[[1], [2], [3]]。在调控这些修饰的多种酶类中，脱甲基酶作为重要的“擦除器”，能够动态去除核酸中的甲基基团，从而调节对细胞命运决定至关重要的基因表达程序[[4], [5], [6]]。越来越多的证据表明，异常的脱甲基酶活性与多种恶性肿瘤的发生和发展密切相关，这使得这些酶成为诊断生物标志物和治疗靶点。
两种脱甲基酶在癌症生物学中尤为重要：O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）和脂肪质量与肥胖相关蛋白（FTO）。MGMT是一种DNA修复酶，可去除致突变的O6-烷基鸟嘌呤损伤，其表达状态可作为胶质母细胞瘤等癌症化疗反应的预测生物标志物[[7], [8], [9]]。FTO最初是通过全基因组关联研究发现的肥胖相关蛋白，后来被确认为第一个N6-甲基腺苷（m6A）脱甲基酶，在mRNA稳定性、翻译效率和致癌信号通路中起关键作用[[10], [11], [12]]。这些脱甲基酶在不同肿瘤类型中的差异表达及其在癌症进展中的功能作用，凸显了开发灵敏和特异检测方法的迫切需求。传统的脱甲基酶检测方法，包括折叠-修复DNA纳米开关[13]、荧光甲基化可切换探针[14]和基于质谱的方法[15,16]，虽然提供了有价值的见解，但通常需要细胞裂解、复杂的样本处理或精密仪器，无法在天然生物环境中进行实时分析。
核酸纳米技术的最新进展为监测生物系统中的酶活性提供了创新方法。基于DNA行走器的信号放大策略已与电化学生物传感器成功结合，实现了对DNA甲基转移酶活性的超灵敏检测[17]。DNA酶是通过体外筛选获得的具有催化活性的DNA分子，因其可编程性、稳定性和依赖金属离子的催化特性而受到广泛关注[[18], [19], [20]]。在DNA酶序列中引入表观遗传修饰可以创建响应刺激的生物传感器，这些传感器在特定酶去除阻断基团之前保持催化失活状态。例如，赵等人构建了多种由单碱基延伸和连接驱动的DNA酶，用于监测癌组织中的FTO[21]。最近，周等人开发了mDZ-RhoBAST探针，实现了活细胞中FTO脱甲基化的超分辨率成像，达到了前所未有的空间分辨率[22]。此外，构建的m6A脱甲基化切换脱氧核酶电路实现了FTO活性的体外和原位检测[23]。这些进展共同展示了基于DNA酶平台的表观遗传酶分析的多功能性。
此外，DNA行走器系统——这些沿预定轨道自主运动的分子机器——通过连续的底物转化提供了强大的信号放大能力[[24], [25], [26], [27]]。将DNA酶行走器与纳米颗粒支架结合，实现了活细胞中核酸和蛋白质的灵敏检测，例如用于APE1检测的DNA酶行走器[28]以及癌细胞中突变p53和端粒酶的协同表达成像[29]。
尽管取得了这些进展，脱甲基酶检测领域仍存在重大挑战。虽然荧光探针和基于DNA酶的传感器在单个脱甲基酶检测方面表现出显著的灵敏度，但这些方法通常只针对单一分析物，限制了全面的表观遗传谱分析。例如，尽管最近的研究使用单分子计数[21]、超分辨率成像[22]和脱甲基化切换DNA酶电路[23]展示了优雅的FTO检测策略，但由于潜在的交叉反应性、光谱重叠和需要正交激活机制，同时在活系统中可视化多种脱甲基酶在技术上仍具有挑战性。此外，将体外检测能力转化为体内成像应用还面临探针稳定性、细胞摄取效率和生物相容性的额外障碍。解决这些限制需要结合高灵敏度、多重检测能力和复杂生物基质兼容性的创新传感平台。
在这里，我们报道了基于表观遗传修饰的DNA酶驱动的行走器（EMOWAs）的开发，用于活癌细胞和携带肿瘤的小鼠中MGMT和FTO活性的同时成像。我们的策略利用了两种工程DNA酶变体的正交金属离子要求：N6-甲基腺嘌呤修饰的17E（17E-Me）在Zn2+存在下对FTO敏感，以及O6-甲基鸟嘌呤修饰的（O6MeG）EMOzyme在Mg2+作为辅因子存在下对MGMT敏感。通过将这些EMOWAs固定在金纳米颗粒（AuNPs）上，我们利用了自主行走器在纳米颗粒表面运动带来的荧光淬灭特性和信号放大能力。我们假设这种双功能平台可以实现两种脱甲基酶的灵敏、特异且无交叉反应性的检测，从而基于它们不同的表观遗传特征区分癌细胞亚型，并实现无创的肿瘤体内成像。
