多组学揭示谷氨酸棒杆菌甲醛耐受性进化机制：细胞壁合成与DNA修复的关键作用

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Multi-omics analyses of evolved Corynebacterium glutamicum mutants reveal the molecular responses to formaldehyde stress

为优化C1化合物生物转化效率，需解决甲醛毒性对细胞生长和代谢的限制。本研究通过适应性实验室进化（ALE）获得了甲醛耐受性显著提升的谷氨酸棒杆菌突变株，并整合基因组、转录组和蛋白质组分析，揭示了细胞壁生物合成蛋白上调与DNA修复系统增强是耐受性提高的关键机制，为构建高效的甲醛耐受型底盘细胞提供了新见解。

　　

在当前全球应对气候变化的背景下，利用二氧化碳（CO₂）、甲醇等一碳（C1）化合物进行化学品和燃料的生物制造受到广泛关注。在这一过程中，甲醛（Formaldehyde）作为一种关键的代谢中间体被大量生成。然而，甲醛也是一种高反应性和细胞毒性化合物，它能与蛋白质和DNA中的生物亲核试剂发生反应，促进DNA-蛋白质交联物的形成，从而严重阻碍线粒体呼吸酶（特别是NADH脱氢酶和细胞色素c氧化酶）的活性，并影响细胞代谢和产物合成。这种毒性成为制约C1生物转化效率的主要瓶颈之一。尽管微生物天然具备将甲醛氧化为CO₂的甲醛异化途径来解毒，但这会造成碳以CO₂形式损失，降低生物合成过程的原子经济性。因此，提高微生物对甲醛的内在耐受性，而非依赖降解，对于实现高效的C1底物生物转化至关重要。

谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为一种成熟的工业氨基酸和化学生产平台，同时也是甲醇生物转化中有前景的合成甲基营养底盘。但其甲醛耐受性有限，制约了其在甲醇高效利用中的应用。为了解决这一问题，研究人员开展了一项系统的研究，旨在揭示谷氨酸棒杆菌响应甲醛胁迫的分子机制，并通过适应性进化获得耐受性显著提升的菌株，为理性代谢工程提供靶点。该研究已发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊上。

为开展此项研究，作者主要应用了几项关键技术方法。首先，研究人员以敲除了内源性甲醛异化途径关键基因（adhE和ald）的谷氨酸棒杆菌FM-1为出发菌株，进行了长期的适应性实验室进化（ALE），通过在培养基中逐步提高甲醛浓度（从0.8 mM至2.6 mM）进行胁迫筛选，最终获得了耐受性显著增强的进化突变株（如FM-3）。其次，为了阐明耐受性提升的遗传和分子基础，研究团队对进化菌株进行了全基因组测序，以鉴定在进化过程中积累的突变。同时，他们整合了转录组学和蛋白质组学分析，分别对出发菌株FM-1和进化菌株FM-3在有无甲醛胁迫条件下的基因表达和蛋白丰度变化进行了全面比较。此外，研究还利用基因编辑技术（如同源重组和CRISPR/Cas9系统）在出发菌株中逐一回补验证了关键突变的功能。最后，通过扫描电子显微镜（SEM）观察了关键突变对细胞形态的影响，并利用AlphaFold3对突变蛋白进行了结构预测。

3.1. 进化谷氨酸棒杆菌以提高甲醛耐受性

研究首先证实，敲除了甲醛异化途径的出发菌株FM-1对甲醛高度敏感，在1.0 mM甲醛浓度下生长完全抑制。通过长达200多天、超过290代的ALE，研究人员成功筛选出能够耐受2.6 mM甲醛的进化菌株FM-3。生长曲线分析表明，FM-3在0.8 mM甲醛压力下的比生长速率比FM-1提高了44%，且在1.6 mM甲醛下能够恢复生长，而FM-1则不能。重要的是，甲醛降解实验排除了FM-3耐受性提升源于新进化出的甲醛降解能力的可能性，确认其耐受性源于细胞自身的适应性改变。

3.2. 鉴定赋予细胞甲醛耐受性的关键突变

通过对多个进化菌株进行全基因组测序，研究人员在FM-3中鉴定出超过100个突变。通过功能筛选，他们发现其中三个突变（cgl1199^1015?1032del、cgl1590^535insC和cgl1590^750insG）单独引入FM-1后，能显著改善菌株在甲醛压力下的生长。其中，cgl1199编码转录终止因子Rho，其突变导致第339至344位的六个氨基酸（RNRRGR）缺失。cgl1590被注释为推定的糖异生因子，其突变导致了移码和蛋白质截短。进一步实验表明，同时引入cgl1199和cgl1590的突变具有协同增效作用。

3.3. 甲醛胁迫对出发菌株和进化菌株转录谱的影响

转录组学分析揭示了FM-1和FM-3响应甲醛胁迫的全局性差异。在甲醛压力下，FM-1中有213个基因差异表达，其中中心碳代谢（如糖酵解、TCA循环）相关基因普遍下调。而进化菌株FM-3对甲醛的转录响应更为剧烈，有480个基因差异表达，且与DNA损伤修复（如碱基切除修复、同源重组相关基因）和部分氨基酸代谢相关的基因普遍上调。值得注意的是，在无胁迫条件下，FM-3中超过60%的基因组表达水平与FM-1不同，大量与DNA修复、复制相关的基因被上调，这可能是其在进化过程中为应对甲醛引起的基因毒性而发展的适应性特征。

3.4. 出发菌株和进化菌株的蛋白质组学分析

蛋白质组学数据与转录组学结果相互补充。在甲醛胁迫下，FM-1中与细胞壁生物合成（如MurA, Cg-Ppm1）和DNA损伤修复（如UvrA, RecA）相关的蛋白丰度显著增加。在进化菌株FM-3中，无论有无胁迫，与甲硫氨酸（Methionine）代谢相关的多个酶（如MetB, MetE, CysK等）的蛋白丰度均发生改变。特别在甲醛胁迫下，FM-3中参与细胞壁肽聚糖合成的MurE和DNA连接酶LigA的丰度增加。这些结果表明，细胞壁加固和DNA修复能力的增强是甲醛耐受性的共同关键机制，而甲硫氨酸代谢可能与耐受性存在潜在关联。

3.5. Cgl1590及其截短变体的功能分析

研究人员对关键基因cgl1590进行了深入的功能验证。实验表明，cgl1590的移码突变、不同长度的截短乃至完全敲除，都能提高FM-1的甲醛耐受性，而过量表达Cgl1590则对生长有害，说明cgl1590的功能缺失有利于甲醛耐受。扫描电镜观察发现，携带cgl1590^750insG突变的菌株细胞长度增加，形态异质性更大。序列同源性分析提示，Cgl1590与结核分枝杆菌中定位于细胞生长极、参与细胞壁合成和形态调控的CuvA蛋白相似。因此，Cgl1590很可能通过调节细胞壁合成和细胞形态来影响甲醛耐受性。

综上所述，本研究通过适应性实验室进化成功获得了甲醛耐受性大幅提升的谷氨酸棒杆菌菌株。多组学整合分析系统揭示了细胞应对甲醛胁迫的全局性应答网络，其中细胞壁生物合成机制的上调和DNA损伤修复系统的增强是耐受性提升的核心分子基础。研究成功鉴定出两个关键基因靶点：转录终止因子编码基因cgl1199和推定的细胞形态调控因子编码基因cgl1590。cgl1199的突变可能通过全局性改变转录调控网络来增强耐受，而cgl1590的功能缺失则通过改变细胞壁合成或细胞形态直接发挥作用。这些发现不仅深化了对微生物甲醛胁迫响应机制的理解，更重要的是为通过理性代谢工程改造，构建用于C1化合物生物制造的高效、鲁棒的甲醛耐受型工业菌株提供了明确的基因靶点和理论指导。该研究为克服甲醛毒性这一C1生物转化领域的共性瓶颈问题提供了有效的策略和见解。