代谢与转运工程协同提升酿酒酵母中广藿香醇的高效生物合成

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Metabolic and transport engineering enable efficient de novo biosynthesis of patchoulol in Saccharomyces cerevisiae

本研究针对广藿香醇传统提取效率低、化学合成污染大的问题，通过酶工程、代谢通路优化与转运蛋白工程相结合，构建了高效合成广藿香醇的酿酒酵母细胞工厂。研究人员采用半理性设计改造广藿香醇合酶（PTS），结合"推-拉-抑"策略强化甲羟戊酸（MVA）途径，并首次发现PDR12转运蛋白可有效促进广藿香醇外排。最终在5L发酵罐中产量达2.86g/L，为疏水性萜类化合物的生物合成提供了新范式。

　　

广藿香醇作为一种具有独特香气的倍半萜类化合物，在香料和化妆品行业具有重要价值。传统上，它主要从药用植物广藿香中提取获得，但这种方法效率低下且严重依赖植物资源。化学合成方法虽然存在，但往往步骤繁琐且对环境不友好。随着合成生物学的发展，利用微生物细胞工厂来生产植物天然产物成为一种绿色可持续的策略。酿酒酵母作为一种模式真核微生物，拥有完善的遗传操作系统和内源的甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径，是合成萜类化合物的理想宿主。

尽管前人在酿酒酵母中异源合成广藿香醇方面已取得一定进展，但大多数研究主要关注代谢途径的优化，而对产物转运机制的关注相对较少。疏水性萜类化合物在细胞内的过度积累不仅会产生细胞毒性，还会通过反馈抑制降低代谢通量。因此，如何实现萜类化合物的高效跨膜转运成为制约微生物合成效率的关键瓶颈。

针对这一科学问题，广州中医药大学的研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表了一项创新性研究。他们通过代谢工程、蛋白工程和转运工程的多策略协同，成功构建了高效生产广藿香醇的酿酒酵母细胞工厂。该研究不仅显著提高了广藿香醇的产量，还首次系统探索了广藿香醇的跨膜转运机制，为疏水性萜类化合物的生物合成提供了新思路。

在研究过程中，团队采用了几个关键技术方法：通过分子对接技术预测蛋白与底物的相互作用；利用启动子工程实现代谢通路的动态调控；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达水平；通过两阶段补料发酵工艺优化生产过程；使用气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行产物定量分析。

在蛋白工程方面，研究人员通过对广藿香醇合酶（patchoulol synthase，PTS）进行半理性设计，发现G457E/W276A双点突变能显著提高酶催化效率。实验结果表明，该突变体使广藿香醇产量提高了244%。分子对接分析显示，G457E突变位于Mg²⁺结合位点附近，其带负电的侧链通过电荷平衡机制增强了Mg²⁺配位，从而提高了催化效率。

在代谢网络优化方面，研究团队采用了"推-拉-抑"策略。通过过表达人源低氧诱导因子HIF-1和强化糖酵解途径，增加了乙酰辅酶A的供应。同时，过表达截短型HMG-CoA还原酶（tHMGR）和固醇调控转录因子UPC2-1，强化了MVA途径。通过用葡萄糖诱导型弱启动子P_HXT1替换ERG9启动子，有效抑制了角鲨烯合成竞争途径。此外，增加PTS拷贝数至5个，进一步拉动了法尼基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）向广藿香醇的转化。

在转运工程方面，研究人员通过分子对接和转录组分析发现，ABC转运蛋白PDR12能与广藿香醇有效结合。诱导型过表达PDR12使广藿香醇产量达到372.80±14.92mg/L，比对照菌株提高了47%。这表明PDR12在促进广藿香醇外排方面具有重要作用。

最终，在5L生物反应器中进行的两阶段补料发酵中，工程菌株PT13的广藿香醇产量达到2.86g/L（2856.25mg/L）。这一产量在已报道的微生物合成广藿香醇的研究中处于领先水平。

该研究的创新性在于首次系统探索了广藿香醇的跨膜转运机制，建立了"计算预测-实验验证"的闭环研究策略。通过代谢工程、蛋白工程和转运工程的协同优化，成功解决了萜类化合物合成中产物转运效率低的核心难题。这不仅为广藿香醇的工业化生物制造奠定了基础，也为其他疏水性萜类化合物的生物合成提供了可借鉴的技术范式。未来，通过动态平衡固醇/萜类代谢流、扩展外排转运蛋白库以及优化两相提取工艺等策略，有望进一步提高广藿香醇的产量。