《Synthetic and Systems Biotechnology》：Enhanced spinosad production in
Saccharopolyspora spinosa by employing mannose as an extracellular carbon reservoir and optimizing acetyl-CoA supply pathway
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本研究针对多杀菌素工业生产成本高的瓶颈问题，通过紫外诱变获得高产菌株U7，发现甘露糖替代葡萄糖作为碳源可显著提升乙酰辅酶A供应。进一步通过CRISPR/Cas9技术敲除竞争途径基因manB和leuA并过限速酶基因pdhC，使多杀菌素产量达到537.6 mg/L（较野生型提高6.1倍）。该研究为放线菌次级代谢产物生产提供了碳源选择与代谢通路协同优化的新范式。
在农业生产领域，生物杀虫剂因其环境友好特性备受关注。其中，由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）产生的多杀菌素（spinosad）作为一种大环内酯类杀虫剂，具有高效低毒的特点。然而野生菌株的产量低下导致其工业化生产成本居高不下，这主要源于其复杂的聚酮化合物合成途径中存在多个代谢瓶颈，特别是关键前体乙酰辅酶A（acetyl-CoA）供应不足的问题。
近日发表于《Synthetic and Systems Biotechnology》的研究通过系统性代谢工程策略，成功将多杀菌素产量提升至野生型的6.1倍。该研究创新性地发现甘露糖（mannose）作为碳源可比葡萄糖更高效地促进乙酰辅酶A合成，并通过多组学分析揭示了代谢通路重编程的分子机制。
研究团队采用紫外诱变（UV mutagenesis）、发酵优化和理性遗传改造相结合的组合策略。首先通过紫外诱变获得遗传稳定性良好的高产突变株U7，其多杀菌素产量达到野生型的2.6倍。通过单因素摇瓶实验发现，以甘露糖为碳源时突变株的乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）水平显著提升。进而利用CRISPR/Cas9基因编辑系统，在U7菌株中同步敲除β-甘露糖苷酶基因（manB）和2-异丙基苹果酸合酶基因（leuA），并过表达丙酮酸脱氢酶亚基基因（pdhC），构建三重修饰工程菌U7-ΔmanBΔleuA::pdhC。
3.1. 通过紫外诱变增强多杀菌素产量
研究人员通过致死曲线确定50秒为最佳紫外诱变时间，利用微滴培养组学系统筛选获得高产突变株U7。该菌株不仅多杀菌素产量提高，其生长密度和乙酰辅酶A合成能力也显著增强，说明诱变引起了广泛的代谢表型改善。
3.2. 甘露糖作为胞外碳库促进多杀菌素生物合成
碳源比较实验表明甘露糖是最适碳源，其能显著提升乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平。转录分析显示甘露糖代谢关键基因（manA、pfkA、pyk和pdhA）表达上调，同时发现竞争途径基因manB和leuA的表达也增强，这为后续代谢工程提供了靶点。
3.3. pdhC和leuA基因表达水平改变对菌株生长和多杀菌素生物合成的影响
功能研究表明，过表达pdhC和敲除leuA能显著提高乙酰辅酶A供应和多杀菌素产量，同时缩短对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的半数致死时间（LT50）。相反，敲除pdhC和过表达leuA则产生抑制作用，验证了这两个基因在代谢通量分配中的关键作用。
3.4. pdhC、manB和leuA表达组合优化改善多杀菌素生物合成
三重修饰工程菌的生物量提高25.8%，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平显著提升，最终多杀菌素产量达到537.6 mg/L。时序产量检测显示工程菌在整个发酵过程中（除第4天外）均保持较高产素能力。
3.5. pdhC、manB和leuA组合优化促进多杀菌素生产的机制
比较蛋白质组学分析发现，工程菌中1995个蛋白存在差异表达。KEGG富集显示这些蛋白主要参与氨基酸合成、碳代谢和糖酵解等途径。具体而言，糖酵解途径中磷酸烯醇式丙酮酸磷酸转移酶（PtsI）、果糖二磷酸醛缩酶（FbaA）等关键酶表达上调，而磷酸戊糖途径相关酶表达下调，表明碳流被重定向至乙酰辅酶A合成。此外脂肪酸降解和三羧酸循环（TCA循环）的增强也为多杀菌素合成提供了更多前体和能量。
研究结论强调，通过甘露糖代谢优化与乙酰辅酶A供应通路的协同调控，可实现碳代谢流的高效定向转化。该研究不仅为多杀菌素工业化生产提供了高产菌株，更重要的是创立了一种适用于放线菌聚酮化合物生产的代谢工程新策略，即通过替代碳源选择与关键节点精细调控的组合方法，解决前体供应不足这一共性难题。这种"碳源-通路"协同优化理念对其它高价值天然产物的生物制造具有重要借鉴意义。
