《Nature Communications》：Chemoenzymatic synthesis of pentalenolactones via stereoselective Riley oxidation by engineered P450BM3
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为了解决传统Riley氧化反应依赖有毒试剂、缺乏对映选择性控制的问题，研究人员通过融合文库筛选和定向进化，开发了由工程化P450BM3催化的高立体选择性Riley型氧化。该策略实现了顺式双喹烷底物的酶法去对称化，克级规模获得关键手性砌块，并与化学成环、后期生物合成氧化结合，完成了五烯内酯D及新五烯内酯D的不对称全合成，凸显了蛋白工程与合成化学结合在复杂天然产物合成中的强大能力。
在有机合成化学的舞台上，如何高效、绿色地构筑复杂分子骨架始终是核心挑战。Riley氧化反应作为一种引入氧官能团的强大工具，能够在惰性C-H键上进行直接羟基化，为复杂分子的合成提供了潜在捷径。然而，这一经典的化学反应长期以来面临两大瓶颈：首先，反应通常需要使用如硒氧化物等有毒试剂，不符合现代绿色化学的理念；其次，反应过程普遍缺乏立体选择性控制，难以直接用于构建手性中心。这些局限性严重制约了Riley氧化反应在复杂天然产物不对称全合成中的直接应用，迫使化学家们常常需要设计冗长的迂回路线。为了突破这一瓶颈，一个关键问题摆在了面前：能否开发一种环境友好且具有高度立体选择性的Riley氧化方法？
针对上述挑战，一支研究团队独辟蹊径，将目光投向了自然界的催化剂大师——酶。他们开展了一项融合蛋白工程与合成化学的研究，旨在利用定向进化技术改造细胞色素P450酶，使其能够催化高立体选择性的Riley型氧化反应，并将其应用于具有重要生物活性的五烯内酯类天然产物的高效全合成。这项研究最终发表在《Nature Communications》期刊上。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过构建融合蛋白文库并结合高通量筛选，对来源于巨大芽孢杆菌的P450BM3（Cytochrome P450 BM3）进行定向进化，以获得能高效、高选择性催化目标反应的突变体酶。利用该工程酶对顺式双喹烷（cis-diquinane）底物进行克级规模的生物转化，实现其酶法去对称化。最后，将酶法制备的关键手性中间体与后续的化学成环反应以及源自天然生物合成途径的后期氧化步骤相结合，完成目标分子的不对称全合成。
研究结果
1. 工程化P450BM3的构建与筛选
研究人员选择P450BM3作为起始模板，因其具有已知的氧化活性和可工程化的特性。他们首先构建了一个P450BM3与其还原酶结构域的融合蛋白随机突变文库。通过对该文库进行针对目标顺式双喹烷底物氧化活性的高通量筛选，他们成功获得了活性显著提升的初步突变体。随后，通过多轮迭代的定向进化，包括对活性口袋残基进行饱和突变及组合，最终获得了一个高度优化的P450BM3突变体。该突变体能够以前所未有的效率和对映选择性催化底物的Riley型氧化，实现了从非手性前体到手性羟基化产物的高效转化。
2. 酶促去对称化合成关键手性砌块
利用上述获得的工程化P450BM3突变体，研究人员对潜手性的顺式双喹烷底物进行了生物催化转化。该酶促反应展现出优异的对映选择性和非对映选择性，成功实现了分子的去对称化，以高收率和高光学纯度得到了关键的手性顺式双喹烷醇中间体。更重要的是，该方法具备良好的 Scalability（可扩展性），能够在克级规模上稳定制备该中间体，这为后续的合成应用奠定了坚实的物质基础。该步骤从传统化学方法的无法控制立体化学，转变为酶促的高度立体选择性过程，是本研究的一项核心突破。
3. 与化学合成结合实现五烯内酯全合成
在获得了充足的关键手性砌块后，研究人员规划了通往目标分子五烯内酯D和新五烯内酯D的合成路线。他们首先将酶法制备的中间体通过一系列高效的化学转化，包括关键的分子内环化步骤，构建出五烯内酯的核心碳环骨架。随后，为了引入天然产物中特定的氧化模式（即最后一个羟基），他们巧妙地借鉴了其生物合成途径，在合成后期再次引入了酶催化氧化步骤。通过这种“酶促-化学-酶促”的混合策略，他们最终以简洁高效的路线，完成了五烯内酯D（Pentalenolactone D）和新五烯内酯D（neo-Pentalenolactone D）的不对称全合成，总步骤和总体收率相较于传统全合成路线显示出显著优势。
结论与意义
本研究成功开发了一种基于蛋白质定向进化的生物催化策略，解决了传统Riley氧化反应缺乏立体选择性的难题。通过将P450BM3改造为能够高立体选择性催化Riley型氧化的生物催化剂，实现了对顺式双喹烷底物的高效去对称化，并克级规模制备了关键手性合成砌块。进而，通过将这一创新的酶促步骤与精准的化学转化以及后期生物合成启发的氧化相结合，首次实现了两种五烯内酯类天然产物的不对称全合成。
这项工作具有多重重要意义：在方法论上，它展示了如何通过定向进化赋予天然酶非天然的、具有挑战性的化学反应性，为开发其他难以实现的立体选择性转化提供了范式。在合成应用上，它提供了一条通往结构复杂的五烯内酯类分子的高效、简洁途径。更为深远的是，本研究是合成化学与合成生物学（蛋白工程）深度融合的一个典范，它打破了传统有机合成与生物催化之间的界限，预示着通过理性设计和改造生物催化剂来直接实现理想化学转化，将成为未来复杂分子制造的一种强大工具。这种交叉融合策略，对于其他具有生物活性的复杂天然产物及其类似物的高效合成具有广泛的启示作用。
