基于RTCA技术的甲型肝炎病毒热灭活动力学研究及模型验证

《Applied and Environmental Microbiology》：An RTCA-based assay as an innovative approach for thermal inactivation studies of hepatitis A virus

本研究创新性地应用实时细胞分析（RTCA）技术评估甲型肝炎病毒（HAV）的热灭活动力学，通过与空斑试验（PFU）、完整性RT-qPCR和RT-qPCR方法的对比，证实RTCA能够准确量化感染性病毒减少，并建立Geeraerd模型预测动态温度条件下的病毒灭活，为食品工业制定高效安全策略提供了可靠工具。

　　

甲型肝炎病毒（HAV）是全球急性病毒性肝炎的主要病原体，主要通过粪-口途径传播。热处理是食品工业中广泛应用的病毒灭活手段，但其效果取决于初始病毒载量和检测方法的灵敏度。本研究旨在评估实时细胞分析（RTCA）技术在HAV热灭活研究中的应用价值，并与传统空斑试验（PFU）和分子生物学方法（RT-qPCR、完整性RT-qPCR）进行比较，同时建立热灭活动力学模型。

标准曲线的建立与RTCA定量原理

通过使用xCELLigence系统实时监测FRhK-4细胞感染系列稀释HAV后的细胞指数（CI）变化，研究发现CI₅₀（细胞指数下降50%所需时间）与HAV浓度（log₁₀PFU）呈线性负相关。该标准曲线灵敏度为1 PFU/孔，动态范围达5 log₁₀，为后续热灭活样本的感染性病毒定量提供了基础。

热灭活过程的实时监测

研究系统评估了37°C至80°C温度范围内不同处理时间对HAV感染性的影响。结果显示，随着热处理温度升高或时间延长，tCI₅₀值相应增加，表明感染性病毒数量逐步减少。例如，56°C处理30分钟使病毒滴度降低至3.2 log₁₀PFU，而72°C处理1分钟即可实现2.8 log₁₀PFU的降低。完全灭活的时间-温度组合分别为：37°C（9天）、50°C（24小时）、65°C（10分钟）、72°C（5分钟）和80°C（2分钟）。

灭活动力学曲线的方法学比较

通过四种检测方法获得的灭活动力学曲线显示显著差异。基于细胞培养的方法（RTCA和PFU）呈现相似的病毒灭活轨迹，而RT-qPCR仅检测到轻微的基因组减少（最高2.17 log₁₀），显著高估病毒存活率。完整性RT-qPCR在高温条件（≥65°C）下与细胞培养方法结果接近，但在低温下仍存在高估。

模型筛选与参数计算

通过比较Bigelow、Geeraerd和Weibull三种模型的拟合优度（以RMSE为指标），Geeraerd模型被确定为描述HAV热灭活动力学的最佳模型。基于该模型计算的D值（实现1 log₁₀病毒减少所需时间）显示，RTCA与PFU方法在所有温度下高度一致（如72°C分别为0.14分钟和0.64分钟），而分子方法显著高估D值（RT-qPCR在72°C为12.74分钟）。

温度无关参数与模型验证

通过线性回归推导的次级模型参数显示，在参考温度70°C下的D₇₀值，RTCA、PFU和完整性RT-qPCR结果相近（0.33-0.98分钟），而RT-qPCR高达10.68分钟。Z值（使D值降低10倍所需的温度变化）在各方法间较为一致（7.74°C-10.86°C）。使用动态温度条件（5°C-80°C）对模型进行验证，预测曲线与实验数据高度吻合，证实等温推导参数可可靠预测动态热处理下的病毒灭活。

讨论与展望

本研究首次系统比较了RTCA技术与传统方法在HAV热灭活研究中的性能，证实RTCA作为一种高通量、自动化的感染性定量方法，能够有效克服PFU试验的耗时、劳动密集型缺点。研究建立的预测模型为食品工业制定精准的热处理工艺提供了科学依据。未来研究方向包括拓展至复杂食品基质中HAV灭活评估，以及纳入更多野毒株以增强模型的实用性和普适性。