DNA感知通路非依赖性：九价HPV疫苗中和抗体应答的强度与持久性机制研究

《Journal of Virology》：The magnitude and durability of neutralizing antibody responses to human papillomavirus vaccine do not depend on DNA sensing pathways

本刊推荐：本研究通过严谨的动物实验证实，九价HPV疫苗（9vHPV）诱导的强效持久中和抗体（nAb）应答不依赖于Toll样受体9（TLR9）、环状GMP-AMP合成酶（cGAS）或黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）等DNA感知通路。尽管在疫苗中检测到微量HPV6/18 L1 DNA（5-351拷贝/剂），但基因敲除（TLR9-/-、cGAS-/-、AIM2-/-）小鼠模型显示其抗体滴度与野生型无显著差异。这一发现刷新了对HPV疫苗免疫机制的认知，为亚单位疫苗研发提供新视角。

　　

ABSTRACT

人类乳头瘤病毒疫苗如何引发强效持久的中和抗体应答尚不明确，但这对于疫苗学具有重要价值。九价HPV疫苗除含主要衣壳蛋白L1和佐剂外，据报道还存在重组L1 DNA残留。本研究通过定量PCR检测三个批次9vHPV疫苗中HPV L1 DNA含量，并利用TLR9^-/-、AIM2^-/-、cGAS^-/-、STING^gt/gt、MyD88^-/-等基因缺陷小鼠模型，评估DNA感知通路对疫苗诱导的抗体应答的影响。结果显示，每剂疫苗中仅检出HPV6（5-44拷贝）和HPV18（104-351拷贝）L1 DNA，而其他型别未检出。小鼠实验表明，无论短期（16周）或长期（53-56周）中和抗体滴度，还是骨髓HPV特异性浆细胞频率，缺陷型与野生型小鼠均无显著差异。结论表明，9vHPV疫苗的免疫效果不依赖于DNA感知通路。

INTRODUCTION

抗体在疫苗预防感染性疾病中起核心作用。由于减毒活疫苗不适用于所有病原体或接种者，开发能诱导强效持久抗体应答的亚单位疫苗至关重要。HPV疫苗作为亚单位疫苗典范，可诱导长达数年的稳健体液免疫，其抗体衰减速率极慢，优于许多已获批的灭活/亚单位疫苗。9vHPV疫苗是目前美国唯一上市的HPV疫苗，可预防导致生殖器疣和癌症的9种HPV型别。该疫苗由病毒样颗粒组成，每个VLP由360个L1蛋白单元组装而成。值得注意的是，美国FDA曾报告四价HPV疫苗因生产工艺残留重组L1 DNA，但确认无安全性风险。

外源DNA可通过Toll样受体9、cGAS、AIM2等模式识别受体激活炎症因子和I型干扰素分泌，从而增强抗原呈递。以DNA为基础的佐剂在动物和人体实验中均显示可增强抗体、生发中心B细胞和浆母细胞应答。例如，乙肝疫苗中的TLR9激动剂佐剂CpG 1018相较铝佐剂能显著提升血清保护率。虽然HPV16/18 L1开放阅读框含多个CpG位点，但DNA感知通路是否参与HPV疫苗免疫应答尚未明确。

RESULTS

疫苗中HPV L1 DNA定量分析

通过qPCR检测三批9vHPV疫苗发现，每剂中HPV6 L1 DNA为5-44拷贝，HPV18为104-351拷贝，其他型别均低于检测限。深度测序未检出HPV DNA，且总DNA含量低于Qubit检测阈值，表明DNA残留量极低。

小鼠模型剂量确定

通过剂量滴定实验，60 μL疫苗剂量可诱导与非最高剂量相当的HPV16/18中和抗体应答，故后续实验均采用此剂量。值得注意的是，小鼠接种后抗体动力学与人类相似：第二剂后滴度达峰，第三剂后维持高位，且性别间无差异。

DNA感知通路对峰值抗体应答的影响

分别给野生型、TLR9^-/-、cGAS^-/-、AIM2^-/-、MyD88^-/-、STING^gt/gt及TLR4^del/del小鼠接种9vHPV或等量佐剂。第16周血清分析显示，所有基因缺陷型小鼠的HPV16/18中和抗体滴度与野生型无显著差异，且佐剂对照组无中和活性，证实抗体应答不依赖于上述通路。

长期抗体应答的持久性分析

在第26、40、53-56周持续监测发现，除STING^gt/gt小鼠HPV18抗体滴度提升4.1倍外，其余组别长期抗体水平及衰减速率均无差异。性别间和不同品系间比较进一步支持这一结论。

骨髓浆细胞应答评估

通过ELISPOT检测发现，接种疫苗组HPV16/18特异性IgG浆细胞频率显著高于佐剂对照组，但各基因缺陷型与野生型小鼠无差异。中和抗体滴度与浆细胞频率呈强正相关，印证浆细胞在维持体液免疫中的核心作用。

DISCUSSION

本研究首次系统验证9vHPV疫苗中残留L1 DNA不通过DNA感知通路调控免疫应答。尽管理论上一剂疫苗中DNA含量足以激活TLR9、cGAS等通路，但实验表明这些通路并非抗体持久性的决定因素。与既往研究矛盾的是，本研究发现MyD88缺陷不影响中和抗体应答，可能与实验设计差异有关。研究局限性包括未公开疫苗L1序列可能影响DNA检测准确性，以及未考察MAVS通路作用。未来可聚焦单/双剂接种方案或记忆B细胞应答，深化对HPV疫苗免疫机制的理解。

MATERIALS AND METHODS

实验采用qPCR定量疫苗DNA，C57BL/6J背景小鼠进行免疫实验，通过假病毒中和试验和ELISPOT评估体液免疫。统计学分析采用Kruskal-Wallis检验及线性回归模型，确保结果可靠性。