2022–2024年间泰国犬只中的狂犬病病毒核蛋白和糖蛋白编码序列

《Microbiology Resource Announcements》：Rabies virus nucleo- and glycoprotein coding sequences from dogs in Thailand (2022–2024)

狂犬病病毒在泰国的持续流行促使2022-2024年对8份阳性样本的N和G基因进行Oxford Nanopore测序及基因组分析。通过RT-PCR扩增、测序和系统发育树构建，确认所有样本均属于亚洲-SEA3谱系，与全球主要流行毒株亲缘关系密切，为狂犬病防控提供了基因组学依据。

　　

摘要

狂犬病仍然是泰国的一个主要公共卫生问题。2022年至2024年间收集的8份狂犬病阳性样本的核蛋白（N）和糖蛋白（G）基因通过Oxford Nanopore技术进行了测序。组装和系统发育分析显示这些基因存在遗传多样性，并归属于Asian-SEA3谱系，这支持了持续的基因组监测工作。

公告

尽管实施了控制措施，狂犬病病毒（属于弹状病毒科Rhabdoviridae、Lyssavirus；见图1A）在泰国仍然流行。对核蛋白（N）和糖蛋白（G）基因的基因组监测有助于追踪疫情、评估疫苗效果并制定消除计划。狂犬病病毒的谱系包括Africa-2、Africa-3、印度次大陆、北极相关谱系以及亚洲谱系（见图1中的1和2）。2016年至2021年间，尽管有疫情报告（见参考文献3），但泰国狂犬病病毒的基因组特征并未出现在公共数据库中。本研究报道了来自狂犬病阳性犬样本的N基因和G基因编码序列，以加强基因组监测并记录流行的病毒谱系。2022年至2024年间，从泰国多个省份收集了8份狂犬病阳性犬脑样本（Canis lupus familiaris），并通过直接荧光抗体检测确认阳性（见参考文献4），这些样本作为常规诊断的一部分提交给了国家动物卫生研究所。这些样本属于剩余的诊断样本，无需额外的伦理批准。样本使用Trizol试剂（Invitrogen）进行灭活，病毒RNA使用Foodproof病毒RNA提取试剂盒（BIOTECON Diagnostics GmbH）提取。N基因和G基因片段使用特异性引物扩增：N基因引物来自之前的研究（见参考文献5），G基因引物是根据狂犬病病毒分离株8743THA（GenBank登录号EU293121.1）新设计的。引物结合位点和扩增子大小见图1B和C。使用SuperScript III One-Step RT-PCR和Platinum Taq DNA聚合酶（Invitrogen）以及每种引物400 nM的浓度，生成了重叠的RT-PCR扩增子。逆转录在55°C下进行30分钟，随后是94°C下2分钟，接着是40个循环：94°C 15秒、50°C 30秒、68°C 1分钟，最后在68°C下延伸5分钟，使用T100 Thermal Cycler（Bio-Rad）完成。PCR产物使用AMPure XP珠子（Beckman Coulter）进行纯化。

图1 示意性地展示了（b）狂犬病病毒颗粒和基因组结构，以及（c）核蛋白和（d）糖蛋白基因的引物结合位点和重叠的RT-PCR扩增子。核苷酸位置根据狂犬病病毒分离株8743THA（GenBank登录号EU293121.1）的基因组进行编号。狂犬病病毒（d）核蛋白和（e）糖蛋白编码序列的最大似然系统发育树。多序列比对（N基因1,353个核苷酸，G基因1,575个核苷酸）使用MAFFT v7（网络服务器v7）生成。系统发育树在IQ-TREE v1.6.12中使用ModelFinder选择的核苷酸替换模型（N基因使用GTR+F+I+G4，G基因使用TVMe+G4）和1,000次超快自助法复制构建。节点标签表示自助法支持度。本研究中生成的序列在图中以红色显示。参考序列来自GenBank，根据Zhang等人的标准进行筛选（见参考文献2）。

使用Rapid Barcoding Kit 96（Oxford Nanopore Technologies）对扩增子进行条形码标记，并在MinION Mk1C仪器上使用R10.4流式细胞仪进行测序。碱基调用使用Dorado v7.6.7和MinKNOW v24.11.8完成。读取数据使用Porechop v0.2.4进行接头修剪（见参考文献6），质量评估使用NanoPlot v1.43.0（见参考文献7），长度过滤使用Chopper v0.8.0（见参考文献8），最终得到250,560个读取序列（平均长度141.93 Mb；平均读取长度N50，碱基对439个）。读取序列使用minimap2 v2.28（见参考文献9）映射到参考基因组（GenBank登录号ON808418.1），然后使用samtools和bcftools v1.21（见参考文献10）生成排序比对和一致序列。一致编码序列与GenBank中的参考序列结合，根据Zhang等人的标准进行筛选（见参考文献2），并使用MAFFT（见参考文献11）和IQ-TREE（见参考文献12）进行系统发育分析。

一致组装获得了完整的N基因（1,353个核苷酸）和G基因（1,575个核苷酸）编码区域。N基因和G基因开放阅读框的BLASTn分析确定了最接近的相关菌株（见参考文献1）。最大似然系统发育树将所有泰国序列归入Asian-SEA3谱系，在研究期间未观察到与其他狂犬病病毒谱系的聚集（见图1D和E）。尽管未进行正式的重组分析，但未观察到明显的系统发育不一致性。每个样本的平均测序深度超过100倍，支持了一致性判断。八份泰国序列之间的核苷酸相似度范围为：N基因95.27%至99.60%，G基因93.90%至99.56%。

表1

基因	样本ID	平均测序深度（×）	GC含量（%）	GenBank登录号	Top GenBank匹配结果（身份百分比，登录号）
N	RBV/TH/65F15730/2022	509.62	45.16	PX476146	98.60%（MN075931.1）；98.52%（AB981677.1）
	RBV/TH/65D20651/2022	194.65	45.60	PX476147	99.48%（AY218999.1）；99.33%（LC717423.1）
	RBV/TH/66E13431/2023	315.72	45.16	PX476148	99.11%（OK585051.1）；98.52%（MN075931.1）
	RBV/TH/66E25722/2023	161.07	45.31	PX476149	99.56%（PP700503.1）；99.48%（OP515296.1）
	RBV/TH/66F02089/2023	258.60	45.01	PX476150	98.45%（MW690142.1）；98.30%（MW690139.1）
	RBV/TH/67J02006/2024	118.97	45.23	PX476151	99.48%（MW690139.1）；99.48%（MW690152.1）
	RBV/TH/67D11360/2024	121.74	45.31	PX476152	99.63%（OP515296.1）；99.41%（KM366270.1）
	RBV/TH/65D18791/2022	121.74	45.23	PX476153	98.89%（ON808418.1）；98.59%（KM366242.1）
G	RBV/TH/65F15730/2022	378.15	47.43	PX476154	99.81%（LC360759.1）；99.81%（LC071983.1）
	RBV/TH/65D20651/2022	229.37	47.30	PX476155	98.10%（LC717423.1）；97.97%（AY257982.1）
	RBV/TH/66E13431/2023	314.99	47.75	PX476156	99.94%（LC360776.1）；99.87%（LC360780.1）
	RBV/TH/66E25722/2023	160.20	47.49	PX476157	99.62%（LC360769.1）；99.62%（LC360760.1）
	RBV/TH/66F02089/2023	267.39	47.24	PX476158	99.68%（LC071983.1）；99.68%（LC360759.1）
	RBV/TH/67J02006/2024	144.98	46.98	PX476159	97.20%（MG201920.1）；97.20%（GQ472552.1）
	RBV/TH/67D11360/2024	144.90	47.62	PX476160	99.87%（OP515296.1）；99.75%（LC360769.1）
	RBV/TH/65D18791/2022	137.55	47.56	PX476161	99.17%（ON808418.1）；99.11%（LC071952.1）

^a平均测序深度（×）表示每个基因一致编码序列上映射读取序列的平均覆盖度。

^bTop GenBank匹配结果表示每个序列的前两个BLASTn匹配结果，以核苷酸身份百分比表示，后面跟着登录号；两个匹配结果用分号分隔。

致谢

本研究由美国疾病控制与预防中心（CDC）与泰国畜牧发展部（Award Number: 6NE2HG0013）通过名为“2022–2024年泰国狂犬病病毒的流行病学和遗传特征”项目合作资助。

本报告中的发现和结论仅代表作者的观点，不一定代表美国疾病控制与预防中心的立场。

我们衷心感谢联合FAO/IAEA食品和农业核技术中心通过其培训课程在生物信息学分析流程方面提供的指导。同时感谢NIAH的Nannapat Pengjan女士、Janeira Santo女士和Ratchadaporn Wongsombat女士，以及VRDC（泰国）的Saruda Wanganurakkul女士和工作人员在样本制备和测序方面提供的帮助。