《Particuology》：Polysaccharide-alum Pickering emulsions as adjuvant to stimulate potent humoral and cellular immune responses for porcine pseudorabies virus vaccine
杨润宇|李龙云|张五超|朱一轩|赵倩辉|刘伟|徐盼盼|赵琪|张子业|范英才|赵宽|王晓|马宁|史婉瑜|顾鹏飞
河北农业大学传统中医兽医学院，保定，071001，中国
摘要
使用灭活的猪伪狂犬病病毒（PRV）疫苗进行接种是预防PRV感染的常用策略。然而，由于免疫原性不足，灭活疫苗的保护效果仍然不够理想。因此，迫切需要开发有效的佐剂来增强灭活PRV疫苗的效果。在之前的研究中，我们成功开发了一种新型疫苗佐剂递送系统，该系统采用了茯苓多糖负载的Alhydrogel作为胶体稳定剂，并使用角鲨烯作为油相来形成稳定的Pickering乳液（PAPE）。PAPE结合了茯苓多糖的免疫刺激作用、Alhydrogel佐剂的固有免疫刺激特性以及Pickering乳液递送系统的特点。我们发现，PAPE具有通过Scavenger受体A介导的内吞作用促进巨噬细胞摄取抗原的潜力。PAPE弥补了明矾佐剂在有效刺激细胞免疫反应方面的不足。作为灭活PRV疫苗的佐剂，PAPE增加了注射部位抗原呈递细胞的招募和激活，并引发了强烈的细胞和体液免疫反应。与MONTANIDE ISA206佐剂相比，PAPE显著增强了CD4+和CD8+ T细胞的诱导、CD8+细胞毒性T淋巴细胞的激活、IFN-γ的产生以及记忆CD8+ T细胞的反应，从而诱导了更强的细胞免疫反应。我们的发现突显了PAPE作为PRV疫苗佐剂的效力，为兽医疫苗的开发提供了新的见解。
引言
疫苗接种仍然是预防和控制人类和动物传染病最有效且经济的方法（Burakova等人，2018年；Sallusto等人，2010年）。佐剂是疫苗的重要组成部分，能够显著增强免疫反应的强度、广度和持久性（Pulendran等人，2021年；Tan等人，2022年）。显然，传统的明矾佐剂在人类和兽医疫苗中应用最为广泛，这归因于它们的显著效力和安全性（Burakova等人，2018年；Charerntantanakul，2020年；Jiang等人，2018年；Pulendran等人，2021年）。明矾佐剂通常能引发Th2型体液免疫反应，但无法有效刺激细胞免疫（Li等人，2018年）。因此，明矾佐剂在针对需要Th1型细胞免疫反应的细胞内病原体感染的疫苗中的应用受到限制。最近，人们投入了大量努力来改进明矾佐剂并开发替代佐剂（Jin等人，2025年；Li等人，2018年；Raponi等人，2021年；Xing等人，2025年）。Li等人（2024年）在制备铝佐剂时加入了锰离子，设计出了一种锰改性的铝佐剂。这种佐剂已被证明能有效刺激体液和细胞免疫反应（Li等人，2024年）。Liu等人（2023年）使用N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和硫酸铝合成了复合纳米佐剂。这种纳米佐剂能够增强针对新城疫和H9N2禽流感的联合灭活疫苗的免疫反应（Liu等人，2023年）。
Pickering乳液，也称为颗粒稳定乳液，是由固体颗粒而不是传统乳化剂稳定的乳液。Pickering乳液通过固体颗粒吸附在乳滴表面来稳定，从而降低不相溶相之间的界面能（Sharkawy等人，2020年）。由于其高生物相容性（不含表面活性剂）、良好的稳定性、多层次结构、高比表面积、独特的柔软性和流动性（Ming等人，2022年；Sharkawy等人，2020年），Pickering乳液在佐剂递送系统中的应用受到了越来越多的关注。Pickering乳液的变形能力使它们能够穿透细胞间隙，从而增强组织分散效果。较高的比表面积有助于提高细胞亲和力，促进抗原的内吞过程（Ming等人，2022年）。Xia等人（2018年）报告称，Pickering乳液具有柔韧性和横向移动性，可以增强对抗原呈递细胞（APCs）的亲和力。Pickering乳液佐剂能够促进APCs的招募、抗原摄取和激活，并引发强烈的细胞和体液免疫反应。同时，Peng等人（2020年）证明，使用商业Alhydrogel佐剂和角鲨烯稳定的乳液能够吸附抗原，增强树突状细胞（DCs）的摄取，并促进抗原交叉呈递。因此，明矾稳定的乳液能有效激活针对COVID-19疫苗的细胞和体液免疫反应（Peng等人，2020年）。
在我们之前的研究中，我们成功从茯苓中纯化出一种水溶性茯苓多糖（PCP），其分子量为20.112 kDa，主要由→6)-α-D-Galp-(1→组成，含有少量的→3)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→，显示出很强的免疫刺激活性（Gu等人，2024a）。受到AS04佐剂（吸附在明矾上的单磷酸脂A）制备的启发，我们将免疫刺激剂PCP吸附在明矾颗粒上，得到了PCP负载的明矾（PCP-Al）。鉴于Pickering乳液作为疫苗佐剂递送系统的优势，随后使用PCP-Al作为胶体稳定剂，并以角鲨烯作为油相制备了稳定的茯苓多糖负载明矾Pickering乳液（PAPE）。先前的研究发现，PAPE具有显著的储存稳定性和良好的生物安全性。作为OVA模型亚单位抗原的佐剂，PAPE已被证明能够增强Th1和Th2型免疫反应（Gu等人，2024b）。
猪伪狂犬病是一种由猪伪狂犬病病毒（PRV）引起的严重传染病，是养猪业中最常见的病原体之一，导致了巨大的经济损失（Guo等人，2024年；Liao等人，2023年）。使用安全性改良的灭活疫苗进行接种已成为预防PRV感染的主要策略。然而，灭活的PRV疫苗的免疫原性不足，无法提供有效的保护（Hou等人，2022年；Liao等人，2023年；Yang等人，2024年）。众所周知，常用的明矾佐剂主要负责引发体液免疫反应。相比之下，常用于兽医疫苗的矿物油基佐剂会引起严重的不良反应，包括局部肉芽肿、脓肿和发热。此外，粘稠的油基佐剂不利于注射（Sun等人，2018年）。因此，迫切需要开发一种高效且安全的灭活PRV疫苗佐剂来增强免疫反应和保护效果。
在这项研究中，我们进一步基于先前的研究调查了PAPE是否具有广谱佐剂活性。在本研究中，使用PRV灭活抗原作为模型疫苗。为了评估PAPE作为灭活PRV疫苗佐剂的活性，将基于PAPE的PRV疫苗接种给小鼠，并评估了PAPE-PRV诱导的免疫反应。我们的研究发现，PAPE-PRV促进了注射部位抗原呈递细胞的招募和激活，引发了强烈的抗体免疫反应，促进了浆细胞（PCs）和T滤泡辅助（Tfh）细胞的生成，增强了CD4+和CD8+ T细胞的诱导，增强了CD8+细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）的激活，并刺激了记忆CD8+ T细胞的反应。本研究表明，当PAPE用作灭活PRV疫苗的佐剂时，在诱导适应性体液和细胞免疫方面具有巨大潜力。
材料
PRV灭活抗原溶液（PRV SH15 ΔgE/gI双基因缺失株，1 × 108.13 TCID50/mL）由河北农业大学兽医学院兽医生物制品实验室提供。Alhydrogel?佐剂2%购自Invivo Gen。MONTANIDE ISA206佐剂由SEPPIC提供。小鼠细胞因子ELISA试剂盒均来自Multi Science（Lianke）Biotech有限公司。HRP山羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a和IgG2b及主要抗体
PAPE和基于PAPE的疫苗的特性
在之前的研究中，通过超声处理将PCP加载到商业明矾（Alhydrogel）颗粒上，得到了PCP-Al。随后，使用角鲨烯作为油相和PCP-Al作为固体颗粒稳定剂，成功制备了稳定的PCP-Al-Pickering乳液（PAPE）（Gu等人，2024b）。在此过程中，PRV抗原被吸附在PAPE上，得到了基于PAPE的PRV疫苗（PAPE-PRV）（图1(a)）。PCP-Al呈现出棒状形态，流体力学尺寸为
讨论
研究表明，来自中国传统草药的多糖因其强大的免疫刺激作用、良好的生物相容性和安全性而成为理想的疫苗佐剂候选者（Sun等人，2018年；Wan等人，2022年）。然而，这些多糖存在一些局限性，包括有效浓度范围不足、稳定性差和靶向能力不足，从而影响了它们的生物利用度和临床应用（
结论
在本研究中，我们评估了茯苓多糖负载明矾Pickering乳液（PAPE）作为灭活PRV疫苗佐剂的活性。PAPE佐剂的开发结合了PCP的免疫刺激作用、明矾佐剂的固有免疫刺激特性以及Pickering乳液递送系统的特点。因此，PAPE能够作为抗原递送系统，通过Scavenger受体促进巨噬细胞摄取抗原
CRediT作者贡献声明
杨润宇：撰写——原始草稿、可视化、验证、项目管理、方法学、数据分析、数据整理。李龙云：监督、方法学、研究。张五超：项目管理、方法学。朱一轩：项目管理。赵倩辉：项目管理。刘伟：项目管理。徐盼盼：项目管理。赵琪：项目管理。张子业：项目管理。范英才：项目管理。赵宽：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
该项目得到了河北的< />：河北省中央引导地方科技专项（项目编号：236Z6603G）、国家自然科学基金（项目编号：32302914）和河北农业大学人才引进研究项目（项目编号：YJ2022026）的支持。
