一种用于体内和体外分析内源性多囊蛋白-2定位、周转和运输的HaloTag敲入资源

《ASN Publications》：A HaloTag Knock-In Resource for In Vivo and In Vitro Analysis of Endogenous Polycystin-2 Localization, Turnover, and Transport

本研究通过CRISPR/Cas9构建Pkd2 HaloTag敲入小鼠及肾上皮细胞系，优化了HaloTag在体内外应用，证实该标签不影响Pkd2功能，并发现其在ER和主 cilium的定位及48小时快速周转，同时发现Tulp3突变和Pkd1缺失会阻碍 cilium定位，为ADPKD研究提供新工具。

　　

摘要

背景：

多囊素-2（Polycystin-2），由基因PKD2编码，是一种对肾脏生理功能至关重要的阳离子通道。Pkd2的功能障碍会导致常染色体显性多囊肾病（Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease，ADPKD）。目前，我们对肾脏中囊肿形成的理解受到限制，主要是因为难以观察内源性多囊素蛋白的定位和分子功能。

方法：

我们利用CRISPR/Cas9技术构建了一种带有HaloTag标签的Pkd2敲入小鼠（称为Pkd2^c-Halo），并获得了经tsSV40病毒永生化处理的Pkd2^c-Halo肾上皮细胞系。我们优化了HaloTag标签在体内（in vivo）和体外（in vitro）应用中的效果，验证了其在共聚焦显微镜、活细胞显微镜、脉冲追踪实验（pulse-chase assays）、亲和分离（affinity isolation）以及肾脏损伤后Pkd2蛋白定位研究中的有效性，这些研究是在与疾病相关的Tulp3^{R400W/R400W和Pkd1null突变背景中进行的。}

结果：

纯合的Pkd2^c-Halo小鼠具有正常的生存能力、繁殖能力及表型特征，这表明C端的HaloTag标签并未干扰Pkd2的功能。Western blot检测证实了Pkd2-c-Halo的存在，其定位在内质网（ER）和初级纤毛（primary cilium）上。在体内（in vivo）和培养细胞中，当标签浓度达到≥2 nmol/mouse或≥25 nM时，30分钟内即可观察到标记现象，并在3小时后达到稳定状态。脉冲追踪分析显示，在体内脉络丛的纤毛中，Pkd2-c-Halo在48小时内完全更新；而在培养的肾上皮细胞中，则在24小时内完成更新。HaloTrap亲和树脂能够高效地从细胞和组织中纯化出内源性的Pkd2-c-Halo蛋白，以便进行蛋白复合物分析。尽管肾脏损伤会加速囊肿的形成，但单侧输尿管阻塞并未改变Pkd2-c-Halo的表达或分布。最后，在Pkd1基因缺失的背景或携带Tulp3^{R400W等位基因的小鼠中（该等位基因曾在一名肝肾囊性疾病患者中发现），Pkd2-c-Halo无法在肾小管上皮的纤毛中定位。}

结论：

带有Pkd2-c-Halo标签的小鼠及其衍生的肾上皮细胞系使得能够在体内（in vivo）和体外（in vitro）检测内源性多囊素-2，从而可以分析其在稳态条件下的定位情况、肾脏损伤后的变化，以及在不同遗传背景下的表达情况。