《ACS Sensors》：miRNA Cell Tracer: Multifunctional Microgels for Spatially Resolved and Wide-Range Detection of Intracellular miRNA at Single-Cell Level
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本综述（研究论文）核心在于开发了一种名为miRNA细胞示踪剂的新型单分子微凝胶生物传感器。该系统通过微流控力学穿孔技术，将功能化的大尺寸（~600 nm）微凝胶高效递送至活细胞胞质，实现了对细胞内低丰度microRNA（miRNA）的高灵敏度（pM级）、宽动态范围（pM-nM）、无扩增、且具有空间分辨能力的定量检测与成像，为活细胞诊断、单细胞基因调控研究提供了强大工具。
引言背景
细胞内DNA、RNA和蛋白质的检测为理解生理和病理细胞过程的调控机制提供了宝贵见解。其中，microRNA（miRNA）作为重要的生物标志物，在健康和疾病状态下的细胞研究中扮演着关键角色。然而，miRNA的小尺寸和低丰度为其检测和定量带来了巨大挑战，使得传统技术如qRT-PCR、微阵列和荧光原位杂交（FISH）在活细胞应用中存在局限。这些方法或需细胞裂解（失去时空动态信息），或面临信号稳定性、特异性及动态范围有限等问题。因此，亟需开发能够在活细胞中实现实时、高灵敏度、高特异性miRNA检测的先进技术。
探针设计与表征
为实现对目标miRNA（如miR-191-5p和miR-363-5p）的高特异性检测，研究团队对分子信标（MB）探针进行了精心设计。通过计算分析（如Primer-BLAST、UNAFold、NUPACK）预测核酸二级结构和杂交热力学，并利用CHARMM软件进行分子动力学模拟，确保了探针与靶标结合的高特异性和稳定性。模拟结果显示，探针与靶标miRNA杂交后形成稳定的双螺旋结构，吉布斯自由能（ΔG）显著降低（例如miR-191-5p复合物为-33.67 kcal/mol），表明杂交后热力学稳定性大大增强。碱基配对概率矩阵分析进一步证实了探针与靶标之间形成双链的高概率，而与非靶标miRNA的杂交概率极低，验证了探针的高特异性。此外，分析表明探针不会与结构更复杂的前体miRNA（pre-miRNA）有效杂交，从而确保了系统对成熟miRNA检测的特异性。
微凝胶的合成、功能化与表征
研究采用了尺寸约为600 nm的生物相容性微凝胶作为传感载体。这些微凝胶通过自由基沉淀聚合法合成，并共价偶联了针对特定miRNA的分子信标探针。接枝效率约为86%，估算每个微凝胶表面携带约2.1×104个MB分子。功能化后，微凝胶的水合动力学直径略微增加至约700 nm，Zeta电位绝对值降低至约-1 mV。这种近乎中性的表面电荷减少了与带负电的细胞膜的非特异性静电排斥，有利于细胞摄取，同时也能减少蛋白质吸附，增强其在胞内的稳定性。扫描电子显微镜（SEM）图像显示微凝胶呈球形且结构完整。稳定性测试表明，在模拟细胞内环境的条件下孵育48小时，微凝胶及其负载的荧光探针均能保持荧光和结构完整性，细胞毒性试验（MTT法）也证实其在长达1小时的暴露下对MCF10A和MCF7细胞无毒性。
微凝胶的细胞内递送：微流控力学穿孔技术
由于微凝胶尺寸较大（>500 nm），其通过自发内吞进入细胞的效率很低。为解决这一大尺寸颗粒的细胞内递送难题，研究团队采用了一种先进的微流控流入式力学穿孔技术。该技术利用粘弹性流体，在可控的压力下使细胞在微流道中发生可逆的膜透化，从而允许微凝胶被动扩散进入细胞质。这种方法与传统的脂质体转染或电穿孔相比，具有细胞毒性低、转染效率均一、且不影响内源性miRNA表达水平的优势，为后续准确的胞内检测提供了生理学完整性保障。共定位分析证实，约80%的微凝胶进入细胞后位于细胞质中，未与内吞囊泡共定位，这为靶标miRNA的光学检测提供了良好的可及性。
细胞内miRNA检测的性能验证
研究以乳腺癌细胞系MCF10A（正常乳腺上皮细胞）和MCF7（乳腺癌细胞）为模型，评估了该“miRNA细胞示踪剂”系统的检测性能。系统选择miR-191-5p（高表达）和miR-363-5p（几乎不表达）作为概念验证的靶标。
首先，通过将功能化微凝胶与已知浓度的合成靶标miRNA在体外孵育，建立了荧光强度与miRNA浓度的校准曲线。该系统实现了5.58 pM的检测限（LOD），动态范围跨越三个数量级（pM至nM），且在双对数坐标下显示出良好的线性（R2> 0.98），证明了其高灵敏度和宽检测范围。
随后，在细胞内检测中，共聚焦显微镜成像和三维重构清晰显示了MCF10A和MCF7细胞中miR-191-5p的信号。微凝胶信号（绿色）与miR-191-5p杂交后产生的荧光信号（蓝色）高度共定位（皮尔逊相关系数在0.75-0.85之间），表明微凝胶成功检测到了胞内靶标。定量分析显示，单个细胞内的微凝胶能够检测到可测量的miR-191-5p信号，且所有信号均高于以miR-363-5p为对照测得的背景信号，证明了系统的特异性。
单细胞定量与空间定位分析
该系统强大的能力在于能够对单细胞内的miRNA进行定量和空间映射。通过校准曲线，可以将每个微凝胶位置的荧光信号转换为局部miRNA的pM浓度。分析发现，miR-191-5p在MCF7细胞中的表达量高于MCF10A细胞，这与qRT-PCR的批量分析结果一致，验证了该方法的可靠性。更重要的是，与只能提供群体平均值的qRT-PCR不同，此方法揭示了细胞间显著的异质性——即使在同一细胞系内，不同细胞间的miR-191-5p表达水平也存在差异。
此外，通过分析微凝胶在细胞xy平面上的位置与对应的miRNA浓度，研究尝试对miR-191-5p的细胞内分布进行了初步绘图。虽然未发现具有统计学显著性的强空间分布规律，但该方法本身具备了实现单细胞水平空间分辨检测的能力。这种空间分辨信息对于理解miRNA在细胞迁移、代谢等过程中的功能至关重要，是传统批量检测技术无法提供的。
结论与展望
本研究成功开发并验证了一种基于单分子微凝胶的生物传感器——“miRNA细胞示踪剂”。该系统整合了高负载探针的大尺寸微凝胶、高特异性的分子信标设计以及高效、低毒的微流控力学穿孔递送技术，实现了在活体单细胞内对miRNA进行无扩增、高灵敏度、宽动态范围、且具备空间分辨能力的检测与定量。该方法克服了传统技术如qRT-PCR（需裂解细胞、存在扩增偏差）和FISH（需固定、动态范围窄）的诸多局限，能够直接反映活细胞的真实状态，并揭示被批量分析所掩盖的单细胞异质性。未来，通过进一步优化，该平台有望用于实时监测活细胞中miRNA表达的动态变化、同时检测多种miRNA，并在活细胞诊断、药物反应分析、以及单细胞基因调控动力学研究等领域发挥重要作用，成为一个强大而 versatile 的工具。
