纸基CRISPR-Cas12a级联反应系统用于病原体基因组双模式检测的研究

《ACS Sensors》：Cas12a-Programmed Modular CRISPR Cascade Reaction on Paper Supports for Dual-Mode Detection of Pathogenic Genomes

本综述创新性地提出了一种基于纸基支撑的低成本、可扩展光学生物传感平台，利用CRISPR-Cas12a级联反应与荧光DNA模板银纳米簇（FNP）实现了三种主要细菌病原体的同步检测。该系统通过字母形纸芯片（“C”代表空肠弯曲菌、“E”代表产志贺毒素大肠杆菌、“L”代表单核细胞增生李斯特菌）实现可视化检测，并创新开发了靶标存在时荧光保留（ON-retention）的双模式信号输出策略，为资源有限地区的病原体检测提供了突破性解决方案。

纸基CRISPR-Cas12a级联反应系统用于病原体基因组双模式检测的研究

研究团队开发了一种创新性的光学生物传感平台，该平台利用经济高效的纸基材料作为固相支撑，通过荧光DNA模板银纳米簇（FNP）与CRISPR-Cas12a级联反应技术，实现了对三种主要细菌病原体的检测与鉴别。这一技术突破为资源有限环境下的病原体监测提供了新的解决方案。

荧光DNA模板银纳米簇（FNP）的制备与表征

FNP是通过将银离子与特定序列的DNA发夹结构在还原剂存在下孵育而合成的。所得FNP在440纳米处有吸收峰，荧光发射中心位于550纳米左右，扫描电镜图像和流体动力学半径测量显示其平均粒径约为150纳米。重要的是，FNP的荧光特性依赖于其DNA支架的完整性，当DNA被降解时荧光会消失，这一特性为后续的酶活性检测奠定了基础。

纸基传感器的构建与酶降解验证

为了验证FNP在固相载体上的兼容性，研究团队使用商用字母打孔器制备了约5毫米大小的“D”形纸基片（代表DNase I）。将FNP沉积到纸基片上后，通过荧光成像观察到稳定的绿色荧光信号。为测试酶降解可行性，部分“D”形基片直接暴露于DNase I处理20分钟。结果显示，经酶处理的样品荧光信号显著减弱，而未处理的样品荧光保持稳定。通过荧光光谱分析和图像区域荧光强度定量，进一步证实了FNP可作为纸基平台上核酸酶活性的有效报告分子。

Cas12a驱动的单靶标检测

研究进一步将CRISPR-Cas12a系统整合到纸基平台中，构建了由“C”、“E”、“L”三个字母形传感器组成的检测阵列，分别针对空肠弯曲菌、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）和单核细胞增生李斯特菌的保守基因组区域。每个传感器预先加载了对应的CRISPR RNA（crRNA）和Cas12a复合物。当存在特定病原体靶标DNA时，相应的Cas12a复合物被激活，引发FNP降解，导致该传感器荧光信号减弱（ON-to-OFF模式）。实验结果表明，该阵列能够特异性识别单一靶标，例如，仅当空肠弯曲菌靶标（t_C）存在时，“C”传感器才会出现荧光损失，而“E”和“L”传感器荧光保持不变。荧光图像定量分析和动力学测量均验证了检测的高特异性。

多重病原体基因组标记同步检测平台

为评估平台在复杂样本中的实用性，研究测试了传感器阵列对所有可能的双靶标组合（[t_C+ t_E]、[t_C+ t_L]、[t_E+ t_L]）以及三靶标组合（[t_C+ t_E+ t_L]）的响应。在双靶标检测中，荧光信号仅在对应的传感器上减弱，例如，[t_C+ t_E]混合物导致“C”和“E”传感器荧光减弱，而“L”传感器信号保留。在三靶标检测中，所有三个传感器均出现荧光减弱，表明成功实现了同步检测。生成的荧光强度热图与预期模式高度吻合，证明了该平台在多重检测中的准确性和可靠性。

通过两步CRISPR反应实现信号从关闭（ON-to-OFF）到开启保留（ON-Retention）的反转

针对FNP固有ON-to-OFF信号模式的局限性，研究设计了一种新颖的两步CRISPR-Cas12a级联反应策略，将信号输出反转为更符合诊断直觉的ON-retention模式。在该设计中，第一步Cas12a反应负责检测靶标并切割溶液中的激活链。若靶标存在，激活链被切割，从而无法启动第二步通用的Cas12a反应，使得FNP免于降解，荧光得以保留（ON信号）。反之，若靶标缺失，激活链保持完整并触发第二步反应，导致FNP降解和荧光消失（OFF信号）。为确保准确性，第一步反应后需在65°C加热20分钟以灭活第一个Cas12a酶。实验验证表明，该策略在单靶标、双靶标及三靶标检测中均能实现靶标依赖性荧光保留，信号输出模式与预期完全一致。

全基因组检测与灵敏度分析

为证明平台对完整基因组的检测能力，研究使用单核细胞增生李斯特菌EGD-e全基因组，通过等温重组酶聚合酶扩增（RPA）选择性扩增其保守区域。随后分别采用ON-to-OFF和ON-retention两种模式对扩增产物进行检测。灵敏度测试表明，两种模式均能稳定检测到低至约40个基因组拷贝。使用更小的圆形纸基片（1 mm²）进行检测，进一步证明了平台的灵活性和高灵敏度。

FNP与F-Q探针的比较

与传统的荧光-淬灭剂（F-Q）标记探针相比，本研究使用的FNP探针在检测灵敏度（~10^-17M）和检测时间（可缩短至约2小时）上与之相当。然而，FNP探针使用的DNA无需化学标记，成本显著低于F-Q探针（DNA成本：FNP约10美分/纳摩尔，F-Q约1.3美元/纳摩尔；单次反应探针成本：FNP约0.4美分，F-Q约1.6美分），显示出其在成本效益和可扩展性方面的巨大优势。此外，FNP探针在数天内能保持信号稳定。

结论

本研究成功构建了一种基于纸基字母形传感器的低成本、可扩展生物传感平台，实现了CRISPR-Cas12a介导的多重病原体基因组检测。平台不仅完成了在固相载体上的靶标识别、酶促降解和信号输出全过程，还创新性地开发了信号反转策略（ON-retention），提升了检测的直观性。结合等温扩增技术（RPA），平台对低拷贝数全基因组展现了可靠的检测能力。该技术的简易性、模块化和低成本特性，使其在即时诊断（POCT）和环境监测领域具有广阔的应用前景。