靶向递送mRNA的透明质酸功能化脂质纳米粒：通过PEG化优化实现活化巨噬细胞选择性治疗

《Biomacromolecules》：Selective mRNA Delivery to Activated Macrophages via Hyaluronic Acid-Functionalized Lipid Nanoparticles with Optimized PEGylation

本研究开发了透明质酸（HA）功能化脂质纳米粒（LNPs），通过优化聚乙二醇（PEG）比例（1.5%降至0.5%），成功实现mRNA向CD44受体高表达的活化巨噬细胞靶向递送。体外实验表明，低PEG化HA-LNPs在维持mRNA转染效率的同时，显著提升对脂多糖（LPS）激活巨噬细胞的摄取选择性，为炎症性疾病精准治疗提供新策略。

研究背景与意义

巨噬细胞作为天然免疫细胞，在多种炎症性疾病中发挥关键作用。当受到病原体相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs）刺激后，巨噬细胞极化为促炎状态，过度分泌肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子，加剧炎症反应。因此，靶向活化的炎症巨噬细胞成为治疗炎症性疾病的重要策略。

传统治疗方法如抗体药物和干细胞疗法存在特异性差、生理屏障等局限。mRNA疗法通过编码功能蛋白调节炎症进程，尤其是脂质纳米粒（LNPs）递送的mRNA制剂展现出巨大临床潜力。然而，炎症环境的复杂性要求递送系统必须能够选择性靶向病变巨噬细胞，避免对健康细胞产生影响。

材料与方法

研究采用微流控混合技术制备两种PEG化程度的LNPs：含1.5% PEG（LNP_1.5%PEG）和0.5% PEG（LNP_0.5%PEG）。核心配方包括离子化脂质D-Lin-MC3-DMA、结构脂质DOPC、胆固醇和DMG-PEG₂₀₀₀，通过N/P比为12的条件封装萤火虫荧光素酶（Fluc）mRNA。

透明质酸-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺（HA-DPPE）偶联物通过EDC/NHS化学合成，并通过核磁共振氢谱（¹H NMR）验证合成效果，计算得到DPPE取代度为9%-13%。采用后插入法将HA-DPPE修饰于LNPs表面，通过超速离心纯化获得HA-LNPs。

纳米粒表征与功能验证

动态光散射显示，LNP_1.5%PEG粒径为155±21纳米，zeta电位-5±2毫伏；LNP_0.5%PEG粒径增大至256±25纳米，电位转为正电（3±4毫伏）。HA修饰后，两种制剂电位均显著降低至-32毫伏左右，证实HA成功包覆。冷冻透射电镜显示HA-LNPs边界呈现不规则云雾状结构，提示表面HA层形成。

通过荧光标记和纳米流式细胞术量化HA包覆效率，发现当HA-DPPE添加量超过10%时包覆效率达到平台期（约20%）。93%的Rhod-PE标记LNPs同时检测到Cy5-HA信号，证明HA修饰的均匀性。

细胞靶向性与摄取机制

流式细胞术证实LPS激活的RAW264.7巨噬细胞CD44表达显著上调。细胞摄取实验显示，LNP_1.5%PEG与HA-LNP_1.5%PEG在活化/静息巨噬细胞中摄取无差异，表明高PEG密度阻碍HA与CD44结合。而LNP_0.5%PEG系列中，HA修饰使活化巨噬细胞摄取量提升2.5倍，静息细胞摄取降低，竞争性实验（预先加入游离HA）进一步证实该过程依赖CD44受体介导。

共聚焦显微镜观察发现，HA-LNP_0.5%PEG在活化巨噬细胞内呈边缘分布，而未修饰LNPs则均匀扩散至胞质，提示两种制剂内化途径不同。这种差异可能与CD44受体的网格蛋白介导内吞途径有关。

mRNA转染效率与生物相容性

荧光素酶报告基因实验表明，LNP_0.5%PEG与HA-LNP_0.5%PEG在活化巨噬细胞中均呈现剂量依赖性荧光素酶表达，转染效率无显著差异。但在静息巨噬细胞中，HA修饰使转染效率降低约50%，再次验证其靶向特异性。MTT实验证实所有制剂在测试浓度下（≤0.5微克/毫升总脂质）均无细胞毒性。

讨论与创新点

研究创新性地发现PEG密度对靶向配体功能的关键影响：1.5% PEG虽保障纳米粒稳定性，但空间位阻效应掩盖HA结合位点；将PEG比例降至0.5%后，HA靶向性充分显现。值得注意的是，尽管HA-LNP_0.5%PEG摄取增强，其转染效率未进一步提升，可能源于CD44介导的内吞途径延缓内涵体逃逸，或HA长链结构干扰离子化脂质与内涵体膜相互作用。

结论与展望

本研究成功构建了具有活化巨噬细胞靶向能力的HA功能化mRNA-LNPs，通过精确调控PEG化程度（0.5%），平衡了制剂稳定性、靶向性和转染效率。该平台为炎症性疾病精准治疗提供新技术路径，尤其适用于关节炎、动脉粥样硬化等CD44高表达相关疾病。未来研究可进一步优化HA分子量、配体密度等参数，提升内涵体逃逸效率。