《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Improved High-Throughput Platform for In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins via an Automated XY Stage (AXYS)
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本刊推荐一项技术突破：研究人员开发出基于全自动XY平台（AXYS）的高通量细胞内快速光化学氧化蛋白质（IC-FPOP）新方法，通过24孔板设计将样品通量提升4倍，单样本处理时间缩短至10秒，显著增强羟基自由基标记效率。该平台采用玻璃培养板与优化激光能量配置，实现对HEK293细胞中1271种蛋白质的氧化修饰，为原位蛋白质结构研究提供关键技术支撑。
引言
细胞水平的结构生物学实验对于弥合分子结构与生物功能认知之间的鸿沟具有关键意义。在天然细胞环境中解析蛋白质结构，能够更真实地反映蛋白质构象、相互作用及修饰状态，尤其对理解动态结构变化至关重要。基于质谱（MS）的结构研究手段因其能识别蛋白质相互作用位点与构象变化区域而备受关注。其中，蛋白质足迹法通过化学标记获取蛋白质结构信息，羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）作为最常用的共价标记方法之一，通过氧化修饰溶剂可及的氨基酸侧链来探测结构特征。
快速光化学氧化蛋白质（FPOP）技术利用248纳米准分子激光光解过氧化氢产生羟基自由基，近年来已拓展至活细胞环境（IC-FPOP），可在大规模蛋白质组层面进行结构分析。早期采用的移动XY平台孵育系统（PIXY）虽将通量提升至六孔板规格，但仍受限于样本重复数少（每孔需100万细胞）与技术重复能力不足的问题。细胞实验固有的生物变异性要求足够重复次数以确保结果可靠性，而珍贵临床样本的稀缺性进一步凸显了开发低样本消耗、高重现性平台的迫切需求。
实验平台设计
新型自动化XY平台（AXYS）采用24孔板设计，通过三维打印板架固定玻璃培养板（预包被纤连蛋白5微克/平方厘米），人胚胎肾细胞（HEK293）接种密度降至20万/孔。系统核心包含可移动载物台、45度角激光反射镜、孔径光阑及由单台蠕动泵控制的试剂分配站（图1）。激光光束直径缩小至15.6毫米，能量损失较PIXY系统降低50%（约40毫焦耳）。通过LabVIEW脚本控制载台移动、过氧化氢添加（35毫升/分钟流速）与激光触发（50赫兹，150毫焦耳/脉冲）的全程自动化。
系统性能优化
对比PIXY系统，AXYS通过移除孵育器顶盖与采用玻璃培养板显著提升激光能量利用率。实验数据显示：玻璃板较塑料板多修饰10%蛋白质（1271±19种），生物学重复一致性提高至55%。过氧化氢浓度测试表明，100毫摩尔浓度条件下修饰蛋白数量最多（1271种），且肽段与残基水平修饰覆盖率最高（图3-4）。值得注意的是，低细胞密度环境下过氧化氢浓度与催化酶活性的动态平衡使100毫摩尔浓度成为最优选择，较200毫摩尔浓度展现更稳定的修饰效果。
修饰定位分析
以波形蛋白（14个修饰肽段）和微管蛋白β链（9个修饰肽段）为例，100毫摩尔过氧化氢条件呈现最广泛的修饰覆盖（图5）。微管蛋白β链的修饰肽段覆盖GTP结合位点（E位点）与紫杉醇结合区域（M环），证实IC-FPOP可用于探测关键功能位点。尽管整体修饰覆盖率仍局限（最高34%），但关键结构域的标记能力为蛋白质-配体相互作用研究提供可能。
结论与展望
AXYS平台将IC-FPOP通量提升至24样本/次实验，单样本处理时间缩短至10秒，样本消耗量降低80%。其自动化设计支持稀有细胞类型与复杂生物模型（如线虫、球状体）的研究，为临床稀缺样本的结构生物学分析开辟新途径。未来需通过优化样品前处理与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）参数提升低丰度肽段检测灵敏度，并探索激光能量参数对修饰覆盖率的优化潜力。该技术平台与交叉学科方法联用，有望成为原位结构解析的关键工具。
