《Frontiers in Neuroscience》：FNR-like unit interacts with C-terminal related residues trigger nNOS reductase domain conformational flexibility change
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本综述系统阐述了神经元一氧化氮合酶（nNOS）还原酶域中FNR样单元与C末端关键残基（如R1400、F1395）相互作用调控构象灵活性的分子机制。研究通过分子动力学模拟揭示NADP(H)/FAD/FMN氧化还原状态转换对结构动态的影响，发现R1173/R1284等新型作用热点，为开发精准靶向nNOS的抑制剂（如改善脑缺血再灌注损伤中NO过量产生）提供了关键结构基础。
引言
神经元一氧化氮合酶（nNOS）在哺乳动物神经系统中催化生成一氧化氮（NO），其过度活化与缺血性脑卒中等神经系统疾病密切相关。nNOS还原酶域作为电子传递的核心单元，包含结合NADP(H)、FAD和FMN的FNR样单元，但该域在生理条件下的动态相互作用机制尚未明确。现有抑制剂如精脒（Spe）和L-NMMA虽能部分抑制NO释放，却无法使nNOS活性恢复正常水平，凸显了对还原酶域结构动态深入解析的迫切性。
研究方法
研究基于nNOS还原酶域晶体结构（PDB ID: 1TLL），采用def2-TZVP基组计算NADP(H)、FAD、FMN氧化/还原态的RESP电荷参数，构建三种氧化还原状态模型：模型1（NADPH还原态）、模型2（FADH2还原态）、模型3（FMNH2还原态）。通过AMBER 24软件进行1.0μs分子动力学模拟，结合MM/GBSA自由能计算、氢键网络分析和残基波动性（RMSF）评估，系统性探讨关键残基（R1400、R1284、R1173、F1395）在辅因子结合与构象调控中的作用。
实验结果
细胞实验显示，LPS诱导的NO过量释放可被Spe/L-NMMA部分抑制，但无法恢复至生理水平，且Western blot检测到NLRP3炎症小体持续激活。分子动力学模拟表明，三种模型均在1.0μs后达到构象平衡，其中模型3的NADP+出现显著解离倾向（RMSD>6?），提示FMN还原态可能引发NADP+结合不稳定性。FAD的腺嘌呤-核黄素夹角在模型3中从30°扩展至100°，暗示其构象变化可能促进电子传递。
氢键分析发现，模型3中辅因子作为氢键供体时平均键数达20个，显著高于模型1（15个）和模型2（18个），且THR761-OG1与FMN-O3（占据率99.6%）等高频氢键对辅因子锚定至关重要。极性接触分析进一步识别出R1400、R1284、R1173、F1395为关键调控残基，其中R1173与FAD吡啶磷酸基团形成稳定氢键（ARG1173@NE–FAD1415@O3）。
RMSF图谱揭示C末端α-螺旋（T1401-I1413）呈现高灵活性，而FNR样单元内残基波动性较低，提示该区域通过刚性结构维持电子传递稳定性。相关性分析显示，模型3中FMN结合域与C末端尾端残基出现显著负相关，暗示二者构象耦合可能影响NADP+结合。
自由能分解与突变模拟验证了关键残基的功能：R1173A突变导致静电相互作用能（EEL）大幅降低，FAD构象偏离野生型；R1284A突变削弱NADP(H)与FAD间结合，证实其电荷中和作用；R1400A突变引起C末端α-螺旋位移，影响FMN结合域空间排列；F1395A突变虽未显著改变总结合能，但π-堆叠作用消失后NADP(H)与FAD间空间阻碍减小，与文献中“F1395摆动促进烟酰胺基团接近FAD”的假设一致。
讨论
本研究通过动态结构分析阐明了nNOS还原酶域中FNR样单元的构象调控机制：R1400和F1395通过调控C末端α-螺旋动态影响电子传递效率，而新发现的R1173则作为FAD结合的关键静电稳定残基。研究更新的辅因子力场参数为高精度模拟提供了工具，突变模型揭示的残基-辅因子互作网络为靶向nNOS的抑制剂设计（如缺血性脑卒中治疗）提供了新思路。未来需结合全长nNOS二聚体结构，进一步探索钙调蛋白结合域（CaMBD）等区域对还原酶域的跨域调控机制。
