《Frontiers in Plant Science》：Integrated metabolomic and transcriptomic analysis of the mechanism underlying leaf variegation in Miscanthus sinensis ‘Zebrinus’
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本研究通过整合代谢组与转录组分析，系统揭示了芒草'斑马'（Miscanthus sinensis 'Zebrinus'）叶片黄斑形成的分子机制。研究发现黄斑区域（YS）特异性富集黄酮类代谢物，其中柚皮素（naringenin）含量显著高于绿叶区域（GS）；转录组分析显示查尔酮合成酶基因（CHS）在YS中表达量达GS的3倍，且与柚皮素积累呈高度正相关（r=0.96）。该研究首次在禾本科植物中构建了"基因-代谢物"调控网络，为观赏植物叶色性状的分子育种提供理论依据。
1 引言
叶片斑驳是观赏植物的重要表型特征，既有助于植物规避虫害侵袭，又赋予其高观赏价值。芒草'斑马'作为一种兼具观赏价值与生态应用潜力的草本植物，其叶片上不规则分布的黄色斑驳是其区别于普通芒草品种的关键性状。目前对植物叶片斑驳形成机制的研究多停留在单一组学层面，而叶片斑驳实际上是基因调控下代谢网络动态变化的综合体现。随着代谢组学与转录组学技术的发展，整合分析为解析植物叶色形成机制提供了新视角。虽然整合分析技术已在木本植物叶色突变研究中广泛应用，但对草本植物叶片斑驳机制的系统研究仍较缺乏。芒草'斑马'条纹性状形成的分子调控机制尚不明确，其黄色区域与绿色区域的代谢物谱系比较、关键代谢物积累模式以及关键结构基因的调控作用均有待阐明。
2 材料与方法
2.1 材料与采集地
研究以芒草'斑马'两种叶表型[斑驳叶黄色区域（YS）与斑驳叶绿色区域（GS）]为实验材料。样品于2024年7月2日9:00-11:00采集自云南山地畜牧科技示范园（103°16′–103°45′ E，25°08′–25°37′ N）。按5点采样法选取10株健康植株丛，每丛采集6片顶端嫩叶。离体叶片立即置于预冷干冰培养箱（-78°C）中，30分钟内完成YS与GS部位的解剖分离。每个样品设3次重复，存于-80°C冰箱。
2.2 代谢物提取与超高效液相色谱-质谱联用
样品经冷冻干燥后研磨成粉末，称取50 mg样品粉末加入1,200 μL预冷的70%甲醇水内标提取液。涡旋处理（每30分钟1次，每次30秒，共6次）后于12,000 rpm离心3分钟。取上清液经0.22 μm微孔膜过滤后存入棕色进样瓶。超高效液相色谱-质谱联用分析参照既往方法进行。原始数据通过ProteoWizard转换为mzXML格式，采用XCMS程序进行峰提取与保留时间校正。代谢物鉴定通过查询实验室自建数据库、整合公共数据库及metDNA方法完成，筛选标准为整合鉴定分数>0.5且质控样品变异系数<0.5。
2.3 转录组分析
使用Trizol提取试剂盒从6个芒草'斑马'叶片样品中提取总RNA。完整的总RNA经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、cDNA片段修饰、磁珠纯化、片段分选和文库扩增等过程。质控合格的测序文库在Illumina平台进行测序。使用FastQC对原始测序数据进行质控，去除测序接头和低质量碱基。采用Trinity完成组装并优化冗余，以每个基因的最长转录本作为unigene的代表参考序列。使用Bowtie2将质控后的测序reads与参考序列进行比对，通过RSeQC统计比对结果。最后采用DESeq进行差异表达分析，以qValue < 0.05且|FoldChange| > 2为筛选标准鉴定显著差异表达基因（DEGs）。RNA-seq数据保存在NCBI数据库（项目编号：1402042）。
2.4 实时定量聚合酶链反应
从不同表型叶片中提取总RNA，使用核酸蛋白检测仪检测RNA纯度（A260/A280比值1.8~2.0），通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。以2 μg总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书在RNase-free系统中进行逆转录反应（25°C 5分钟，55°C 15分钟，85°C 5分钟）。将合成的cDNA用RNase-free水稀释10倍，4°C保存或-20°C长期保存。根据SGExcel Universal SYBR qRT-PCR Mix说明书进行qRT-PCR反应，采用SYBR Green I方法在qRT-PCR仪上运行。每个样品设3个生物学重复，以无模板水为阴性对照。选择在YS和GS间表达相对稳定且无显著差异的基因作为内参基因校正上样量（内参基因引物F：TTGGGTTTGTTAGGGGCCA；R：GGCTTTCAGAGATGCACATGA）。最终通过2?ΔΔCt法计算靶基因的相对表达量。
2.5 数据处理与统计分析
所有数据统计分析在Excel中完成，采用SPSS 27.0软件进行单因素方差分析和Duncan新复极差检验。代谢组和转录组数据的功能富集分析和热图生成在Metware云平台进行。代谢组与转录组的共富集分析图通过Metware云平台绘制，基于富集通路计算差异基因与代谢物的相关性，使用Cytoscape生成相关性网络图。
3 结果
3.1 不同表型叶片的代谢组差异分析
主成分分析（PCA）结果显示，YS与GS在得分图上呈现明显的组间分离，而组内样品紧密聚集。表明各组样品具有良好的生物学重复性，组内样品代谢组数据高度一致，YS与GS之间存在清晰显著的代谢组差异。非靶向代谢组分析共鉴定到4,036个代谢物，分为21个代谢类别。其中有机酸占比最高（26.16%），其次为氨基酸及其衍生物，黄酮类化合物（排除"其他"类别后）位列第三。组间差异代谢物筛选获得YS组较GS组显著上调代谢物653个，显著下调代谢物354个。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，组间差异代谢物在黄酮生物合成通路中显著富集。层次聚类分析进一步显示，氨基酸及其衍生物、有机酸以及苯及其衍生物等代谢类别在GS中显著富集；而黄酮类化合物在YS中特异性显著富集。这些数据共同提示黄酮代谢通量显著增强与叶片斑驳表型形成存在潜在密切关联。
3.2 叶片斑驳相关代谢物
通过整合KEGG通路富集分析与聚类分析，发现YS与GS间差异代谢物在黄酮生物合成通路中显著富集。对黄酮代谢物进行二级分类统计发现，黄酮类含量最高，其次为黄酮醇类。选取组间差异最显著的10个黄酮代谢物进行表达模式热图分析，新橙皮苷（neohesperidin）、花旗松素（taxifolin）、柚皮素（naringenin）和黄腐醇（xanthohumol）在YS组的表达量显著高于GS组；而槲皮素（quercetin）、白飞燕草素（leucodelphidin）、柚皮苷（naringin）、樱花素（sakuranetin）、没食子儿茶素（gallocatechin）和儿茶素（cianidanol）在YS组的表达量明显低于GS组。其中柚皮素的表达水平改变可能是调控黄色叶片斑驳形成的关键代谢物。
3.3 NR注释分析
转录组序列组装后与非冗余蛋白序列数据库（NR）进行比对评估。芒草'斑马'转录本序列与芒草（Miscanthus lutarioriparius）匹配数量最多（30,043），其次为栓皮栎（Quercus suber）（14,617）、高粱（Sorghum bicolor）（8,126）、玉米（Zea mays）（5,874）等。值得注意的是，芒草、高粱、玉米、柳枝稷（Panicum virgatum）和饿稻（Digitaria exilis）均属于禾本科，与芒草'斑马'分类关系较近。表明本研究获得的芒草'斑马'转录本序列可靠性高，可支持后续功能基因挖掘与分子机制研究。
3.4 不同表型叶片差异表达基因分析
对YS组和GS组样本的转录组数据维度分布特征进行PCA分析，结果显示组内重复性好且组间差异显著。通过RNA-seq技术筛选YS与GS间的DEGs，共鉴定到5,252个DEGs，其中3,012个基因显著上调，2,240个基因显著下调。富集分析显示这些DEGs在黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路中显著富集。推测叶片斑驳的形成可能主要受黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路调控，这些通路中关键基因的差异表达可能为叶片表型分化提供必要的分子基础。
3.5 qRT-PCR分析
从黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路中分别选取5个在YS中表达显著差异的候选基因，通过qRT-PCR验证分析其表达水平。结果显示，除CYP73A基因在YS与GS间的表达水平无显著统计学差异外，其余9个候选基因在YS中的表达水平均显著高于GS。进一步分析发现，CHS、F3H和ANR在两种表型中的整体表达丰度最高。其中YS中CHS基因的表达水平约为GS的3倍，表现出极显著的表型特异性差异。表明CHS基因可能是调控芒草'斑马'叶片斑驳黄化的关键候选基因。
3.6 代谢组与转录组整合分析
整合代谢组与转录组数据以阐明芒草'斑马'叶片斑驳形成的核心调控通路。结果显示黄酮生物合成是调控叶片斑驳形成的主要通路。在此基础上进一步构建了叶片斑驳形成关键黄酮代谢物与DEGs的相关性网络图。发现查尔酮合成酶基因CHS（TRINITY_DN65620_c0_g2）与代谢物柚皮素（pme0376）的相关性系数最高，达到0.96。推测CHS基因可能是芒草'斑马'叶片中柚皮素生物合成的关键调控基因。
4 讨论
植物叶色表型变异是多因素协同调控的复杂生物学过程。本研究利用芒草'斑马'两种不同叶色表型GS和YS，结合KEGG通路共富集分析，通过整合代谢组学、转录组学技术系统研究了芒草'斑马'叶片斑驳的代谢调控机制。
两种表型叶片差异代谢物的筛选与富集分析表明，这些差异代谢物在黄酮生物合成通路中显著富集。黄酮类化合物是芒草'斑马'黄色叶片斑驳形成的关键代谢物，其中柚皮素在YS中显著积累。已有研究证实黄酮类化合物的积累水平和组分差异对驱动植物叶/花色表型分化具有重要调控作用。本研究结论与既往研究一致，进一步证实黄酮类化合物的特异性积累是芒草'斑马'黄色斑驳形成的核心原因，柚皮素可能是介导该叶色表型形成的关键功能代谢物。这一结论与柚皮素引起"肉桂"茶叶片黄化的研究相吻合，进一步确认柚皮素是叶片黄色斑驳的主要责任代谢物。
对芒草'斑马'GS和YS组织的比较转录组分析显示，DEGs在黄酮生物合成和苯丙烷生物合成通路中显著富集。这与植物叶片斑驳往往伴随次级代谢通路重塑的普遍规律相符，证实植物叶色分化可能由色素合成与代谢相关基因的表达变异决定。黄酮类是植物中广泛存在的水溶性色素，其种类和含量直接影响叶片表型，同时也是植物重要的次级代谢产物。该通路的调控依赖于CHS和F3'H等关键酶基因的协同作用，其表达变化可直接改变叶片中黄酮含量，进而引发叶片斑驳。CHS是黄酮合成的限速酶，其高表达可强力驱动代谢流向黄酮合成方向进行，进一步促进植物体内黄酮色素的定向积累。本研究中YS的CHS表达量显著高于GS，同时前期生理测定结果揭示YS的总黄酮含量高于GS。因此，黄酮生物合成通路的差异化激活可通过调控黄色色素合成与积累，作为芒草'斑马'YS表型形成的直接驱动因素。
苯丙烷途径作为植物次级代谢的中心上游通路，其核心酶PAL可催化苯丙氨酸向肉桂酸的转化，为下游黄酮生物合成等通路提供共同前体，形成色素合成的"物质基础"。该通路的活性可直接决定下游色素合成前体物质的供应效率，进而影响最终色素积累水平。本研究中PAL和C4H的表达量在YS中均显著高于GS，表明YS组织中苯丙烷通路被特异性激活。PAL和C4H的协同高表达使下游黄酮通路获得更充足的肉桂酸前体供应，形成"上游供体增加-下游色素合成增强"的代谢流协同效应。相比之下，GS组织中PAL和C4H均低表达，表明黄酮合成前体供应不足，黄色色素积累量低，最终维持以叶绿素为主导的绿色表型。这一机制符合植物次级代谢"上游通路支撑下游产物合成"的普遍规律。
5 结论
本研究通过代谢组与转录组联合分析，得出影响芒草'斑马'叶片斑驳形成的主要代谢物为柚皮素，CHS是调控其叶片斑驳形成的关键因子。此外，柚皮素与CHS呈现高度相关性，初步推测CHS基因的表达与柚皮素的代谢积累存在密切内在联系。CHS基因可能通过介导植物体内柚皮素物质的合成与分布参与黄色叶片斑驳的形成过程。本研究揭示了芒草'斑马'叶片斑驳形成的分子基础，填补了禾本科植物叶片斑驳形成机制研究的空白，为其他草本植物叶片斑驳表型形成机制提供了重要理论参考。
