《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Microglial heterogeneity: influence of human 2D, 3D, and co-culture models on gene expression and immune function
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本文系统评估了不同培养维度（2D/3D）及细胞环境（单培养/神经胶质共培养）对人类单核细胞衍生微胶质细胞（MDMi）转录状态的影响。通过单细胞RNA测序技术，研究揭示了四种微胶质细胞亚型（干扰素应答型、趋化因子富集型、代谢活跃型、增殖型）的分布规律，发现三维培养体系能更好地模拟体内微环境，促进细胞异质性和功能多样性。该研究为神经退行性疾病模型构建提供了关键理论依据。
引言
慢性神经炎症在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化（ALS）等神经退行性疾病进展中起着关键作用。作为中枢神经系统（CNS）的常驻免疫细胞，微胶质细胞表现出显著的表型和功能多样性，其状态受局部微环境信号调控。尽管现有先进的人类微胶质细胞体外模型，但培养维度（二维/三维）和细胞环境对微胶质细胞状态组成的影响尚未明确。本研究通过分析单细胞RNA测序数据，系统比较了二维单培养、三维单培养及三维神经胶质共培养条件下人类单核细胞衍生微胶质细胞（MDMi）的转录特征。
材料与方法
研究采用健康供体外周血单核细胞分化的MDMi，分别置于二维单培养、三维Matrigel基质单培养及含ReNcell VM来源神经组分的三维共培养体系中。通过荧光激活细胞分选（FACS）分离CD11b+细胞，使用10x Genomics平台进行单细胞RNA测序。数据经过Seurat软件标准化处理，采用UMAP/t-SNE可视化聚类结果，并通过Monocle3进行伪时间轨迹分析。
结果
微胶质细胞亚型鉴定与培养维度相关特征
单细胞转录组分析揭示了四种重复出现的微胶质细胞状态：干扰素（IFN）应答型、趋化因子富集型（CC）、代谢活跃型和增殖型。二维培养中IFN应答型微胶质细胞占主导（53.8%），高表达IFITM2和IFITM3基因；而三维体系则表现出更均衡的细胞类型分布，代谢活跃型（14.5%）和趋化因子富集型（20.7%）比例显著增加。三维共培养系统进一步促进了增殖型微胶质细胞的扩增（4.56%），其特征基因包括MKI67和TYMS。特别值得注意的是，三维环境诱导了CCL2/CCL5/CCL7等趋化因子及CSF1、VEGF/FLT1信号通路的特异性激活，揭示了细胞间通讯的维度依赖性调控。
通路富集模式的环境依赖性
二维培养中的趋化因子富集型微胶质细胞主要富集于病毒应答、吞噬作用等免疫监视通路。三维培养则显著激活细胞因子产生、免疫活化及细胞运动相关基因程序。在三维共培养体系中，ERK1/ERK2信号传导、细菌模式识别和II型干扰素应答通路进一步强化。干扰素应答型微胶质细胞在三维环境中展现出NF-κB信号通路和细胞周期相关程序的差异性激活，表明培养复杂度的增加能够拓展微胶质细胞的转录功能谱。
核心微胶质特征基因的保守性与环境特异性
尽管培养环境不同，关键微胶质标志基因如SELENOP、NUPR1、FOLR2和C1QA在所有模型中均稳定表达。三维条件特异性上调FCGBP和IGSF21等细胞间相互作用基因，而三维共培养系统独特诱导LYVE1、SERPINB2等免疫调节基因表达。伪时间轨迹分析显示，二维培养呈现线性分化路径，而三维和共培养系统则出现分支化轨迹，印证了复杂环境中微胶质细胞状态转换的多样性。
培养模型与参考数据集的基准比对
与十个人类微胶质参考数据集比对发现，三维和共培养模型与Olah等人报道的原代微胶质基因签名重叠度最高（430-597个基因），显著优于二维培养（139-483个基因）。疾病相关微胶质细胞（DAM）标志基因如TREM2和LPL呈现簇特异性表达模式，而非全局激活，说明培养环境可选择性地调控疾病相关转录程序。
讨论
本研究证实培养架构是微胶质细胞身份和免疫应答的关键决定因素。二维培养倾向于维持干扰素主导的免疫警戒状态，而三维系统通过提供空间结构和细胞间相互作用，支持更接近体内的转录多样性。神经胶质共培养进一步引入CCL2/CCL5/CCL7、CSF1等细胞通讯信号，模拟了脑微环境中的多细胞互作网络。这些发现为神经免疫研究模型的选择提供了重要指导，强调在疾病机制研究和药物开发中需充分考虑培养系统的生理相关性。未来研究需结合功能验证实验，进一步阐明转录组多样性对应的生物学表型。
