抗原展示型益生枯草芽孢杆菌孢子在鱼类中诱导菌株依赖性免疫调节

《Frontiers in Marine Science》：Antigen-displaying probiotic Bacillus subtilis spores induce subtle, strain-dependent immunomodulation in fish

本研究系统评估了两种鱼类肠道来源的益生枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）孢子展示弧菌外膜蛋白（OmpK/TolC）的免疫调节效应，通过体外（RTgutGC细胞）、离体（海鲈肠道外植体）及体内（欧洲海鲈口服免疫）实验，揭示其菌株特异性免疫激活特性（如FI314孢子上调il1b/il8表达），但30天饲喂未引发显著适应性免疫应答。研究强调优化菌株选择、抗原设计及免疫方案对开发口服孢子疫苗的重要性。

　　

1 引言

水产养殖的集约化发展伴随弧菌病等传染病的暴发，传统注射疫苗存在操作压力大、幼鱼不适用等局限。口服疫苗能实现大规模免疫且靶向黏膜免疫系统，但面临抗原易降解、吸收效率低等挑战。枯草芽孢杆菌孢子因其耐胃肠道环境、表面展示抗原能力及益生特性，成为理想的口服疫苗递送平台。本研究选取从欧洲海鲈和金头鲷肠道分离的益生枯草芽孢杆菌FI314与FI442菌株，通过表面展示弧菌外膜蛋白OmpK与TolC，系统评估其免疫调节潜力。

2 材料与方法

2.1 菌株与孢子制备

实验采用枯草芽孢杆菌FI314、FI442及实验室标准株168，通过孢子培养基诱导产孢并纯化。利用基因工程技术将OmpK（28 kDa）与TolC（48 kDa）与孢子外壳蛋白CotY（18 kDa）融合，构建重组菌株（如FI314O、FI314T）。Western blot验证融合蛋白表达，虽信号较弱但检测到预期条带（OmpK融合蛋白约46 kDa，TolC融合蛋白约66 kDa）。

2.2 免疫效应评估模型

通过三层次实验验证免疫响应：

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  体外实验：用孢子（1×10⁸CFU/mL）刺激虹鳟肠道上皮细胞（RTgutGC），检测免疫基因（il1b、il8、casp3a2等）表达；
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  离体实验：欧洲海鲈肠道外植体经孢子预处理后，以弧菌（Vibrio anguillarum，1×10⁷CFU/mL）攻击，分析免疫标记物（ifng、il10等）动态变化；
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  体内实验：海鲈饲喂含孢子饲料（5×10⁹CFU/kg）30天，通过血清IgM检测、头肾与远端肠道基因表达及RNA-seq转录组分析评估全身与黏膜免疫响应。

3 结果

3.1 孢子构建与抗原展示

重组孢子蛋白电泳图谱与亲本株基本一致，Western blot显示OmpK与TolC融合蛋白成功表达，但信号强度受孢子结构复杂性影响。

3.2 体外与离体免疫激活

FI314孢子及其TolC衍生株（FI314T）显著上调RTgutGC细胞的il1b与il8表达，并抑制凋亡相关基因casp3a2，而FI442孢子无此效应。离体实验中，FI314T孢子预处理后弧菌攻击可诱导抗炎因子il10上调，且所有孢子均增强ifng响应，提示其具备免疫 priming 作用。

3.3 体内免疫响应微弱

30天饲喂后，抗原展示孢子（FI314O/FI314T）未引起血清IgM显著变化，头肾与肠道免疫基因表达仅见il1b在FI314O组轻微上调。RNA-seq显示FI314孢子下调细胞增殖通路，而OmpK孢子激活先天免疫相关基因（如趋化因子3样、IL-6家族细胞因子M17），TolC孢子则影响代谢与DNA复制通路。

4 讨论

FI314孢子通过诱导il1b/il8等促炎因子表达及抑制凋亡，展现菌株特异性免疫刺激潜力，但长期口服未触发强适应性免疫，可能与抗原剂量、黏膜耐受机制相关。FI442的弱免疫原性进一步印证益生菌效应的菌株依赖性。研究强调需综合优化菌株筛选、抗原递送效率及免疫程序，以推动孢子疫苗在水产疾病防控中的应用。