《Frontiers in Microbiology》：A novel internal reference microorganism-based method reveals wild-enriched Penicillium for enhancing growth and disease resistance in Fritillaria thunbergii
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本研究创新性建立基于宿主特异性内参微生物（IRM）的相对丰度差异微生物分析（IRMRA-DMA）方法，有效克服传统相对丰度分析（PA-DMA）因数据组成闭合性导致的假阳性/假阴性问题。通过该方法成功筛选出野生浙贝母（Fritillaria thunbergii）根际核心功能菌属青霉菌（Penicillium），并证实其通过溶解无机磷、产生铁载体、拮抗病原菌（Fusarium oxysporum/Alternaria tenuissima）及激活PR1/PR2防御基因表达等机制，兼具促生与抗病双重功能，为植物微生物组"再野生化"策略提供理论依据与微生物资源。
1 引言
浙贝母（Fritillaria thunbergii Miq.）作为重要中药材，其栽培过程中球茎腐烂病发病率高达22%以上，严重制约产业发展。长期驯化导致的"驯化综合征"表现为栽培品种抗病性显著减弱，而根际微生物群落演变是关键影响因素。传统基于相对丰度的差异微生物分析（PA-DMA）因数据组成闭合性（compositional bias）难以反映微生物绝对丰度变化。本研究通过构建宿主特异性内参微生物（IRM）校正体系，建立IRMRA-DMA新方法，旨在精准挖掘野生浙贝母根际有益微生物资源。
2 材料与方法
2.1 样本采集与处理
在浙江海曙（HFt）、磐安（PFt）栽培区及长兴野生区（WFt）采集浙贝母根际土壤，同步采集伴生植物（Lycoris radiata/Brassica pekinensis）根际土作为对照。通过ITS扩增子测序（引物ITS1/ITS4）获得2,323个真菌ASVs，基于DADA2算法进行质控和注释。
2.2 IRM筛选与IRMRA-DMA方法构建
通过三地区浙贝母-伴生植物真菌属共存分析，筛选出仅存在于浙贝母根际的稳定真菌属Clavatospora作为IRM。以IRM相对丰度为内参，重新计算其他真菌属的相对群落数量（RCQ=目标菌属丰度/IRM丰度），并通过Wilcoxon检验和Kruskal-Wallis检验进行差异分析。
2.3 功能验证实验
从野生根际分离165株真菌，聚焦青霉菌属（Penicillium）菌株WFt-032（鉴定为P. korosum）和WFt-056（P. aculeatum）。通过透明圈法测定溶磷指数（SI）和铁载体产生指数（SPI），采用平板对峙和发酵滤液法评估对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和细极链格孢（Alternaria tenuissima）的抑制率，并检测处理后的浙贝母球茎PR1/PR2基因表达变化。
3 结果
3.1 根际真菌群落结构差异
野生型（WFt）真菌网络具有更高复杂度（节点126，边682）和模块化程度，而栽培型（HFt/PFt）网络结构简化。FUNGuild功能预测显示野生型丛枝菌根（0.62% vs 0.004%）和内生菌（4.02% vs 0.01%）丰度显著高于栽培型，潜在病原菌则呈相反趋势。
3.2 IRMRA-DMA方法优势
与传统PA-DMA方法相比，IRMRA-DMA将栽培型样本的微生物总丰度校正提高至野生型的14-18倍（PFt：679.56 vs WFt：37.37），有效消除高丰度菌属的"压缩效应"。两种方法共同筛选出17个野生富集菌属，IRMRA-DMA额外识别出低丰度差异菌属Trichomonascus，并排除9个PA-DMA假阳性菌属。
3.3 青霉菌功能验证
WFt-032和WFt-056均具溶磷（SI=1.05-1.07）和产铁载体能力（SPI=2.14-16.8）。对峙实验显示对尖孢镰刀菌抑制率达54.67%（WFt-032）和17.3%（WFt-056），发酵滤液处理可诱导PR1/PR2基因表达上调最高5.15倍，显著延缓球茎腐烂进程。
4 讨论
IRMRA-DMA方法通过伴生植物生态位保守性校准环境因素对微生物总负载量的影响，突破相对丰度分析局限。野生浙贝母根际青霉菌的促生-抗病双功能特性，验证了"植物微生物组再野生化"策略在修复栽培品种生态功能中的潜力。未来需结合数字PCR等绝对定量技术进一步验证IRM的区域稳定性。
5 结论
本研究建立的IRMRA-DMA方法为根际微生物精准筛选提供新范式，分离的野生源青霉菌株为浙贝母病害绿色防控提供了高效微生物资源，也为其他药用植物驯化综合征的微生物干预提供参考。
