概念验证研究：APOE4基因表达的脑内皮细胞作为表型化合物筛选工具

《Alzheimer's Research & Therapy》：Proof-of-concept study: APOE4 brain endothelial cells as a phenotypic compound screen

本研究旨在验证APOE4脑内皮细胞作为表型化合物筛选模型的可行性。通过优化体外分离和LPS诱导渗透性改变的实验条件，并采用NIH指南建立统计验证的筛选流程，从900余种化合物中筛选出33种保护性化合物。其中，PDE5抑制剂（西地那非）、HDAC抑制剂（ vorinostat）、RAF抑制剂（CCT196969）和AXL抑制剂（SGI-7079）在体内实验中显著改善APOE4小鼠的急性LPS诱导脑血管功能障碍。研究证实该体外模型能有效筛选具有神经保护作用的化合物。

摘要

背景

已发表的数据表明，与APOE3相比，APOE4可能通过增加脑血管的通透性来增加神经退化的风险。我们最近提出了一种观点，即脑内皮细胞中的APOE以基因型特异性的方式保护脑血管功能，即APOE3优于APOE4，因此APOE4脑内皮细胞在衰老和疾病过程中可能更容易出现功能障碍。除了机制上的意义外，我们的概念和方法可能还具有治疗应用价值，即识别能够保护APOE4脑内皮细胞的化合物。这项概念验证研究的目的是确定APOE4脑内皮细胞是否可以用作表型化合物筛选工具。

方法

我们之前发现，当通过体外跨内皮细胞电阻（TEER）测量时，APOE4脑内皮细胞对脂多糖（LPS）诱导的通透性破坏特别敏感。在这里，我们遵循NIH检测指南手册将我们的体外检测方法转化为表型筛选方法。我们调整了分离方案，选择了最小、中等和最大信号的条件，对表型检测进行了统计验证，筛选了化合物，验证了有效化合物，并在体内测试了其中最有效的几种。

结果

我们调整了分离方案，并选择了最小（0.8 μg/ml LPS）、中等（10 μM sildenafil/LPS）和最大（溶剂）条件。最终方案符合统计验证检测的可重复性标准。随后，我们从TargetMol生物活性库中筛选了约900种分子，发现了两组主要化合物。第一组化合物通过毒性作用或降低TEER来破坏APOE4脑内皮细胞功能，其中许多化合物还能抑制mTOR；第二组化合物则能防止LPS引起的TEER降低。通过相对严格的标准，我们识别出33种具有保护作用的化合物，这些化合物可分为两类：一类抑制生长因子受体信号通路，另一类抑制多种细胞内信号通路。我们比较了最有效的化合物，并选择了四种在体内进行测试。他达拉非（PDE5抑制剂）、伏立诺他（HDAC抑制剂）、CCT196969（raf抑制剂）和SGI-7079（AXL抑制剂）能够缓解表达APOE4的小鼠中由LPS引起的急性脑血管功能障碍。

结论

总体而言，我们的数据支持我们的体外筛选方法在识别能够防止APOE4脑内皮细胞因LPS而出现功能障碍的化合物方面的潜力。