《Circulation: Genomic and Precision Medicine》：Integrative Proteomic and Lipidomic Analysis of Post–Myocardial Infarction Patients Treated With PCSK9 Antibodies and Statins
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本综述通过整合蛋白质组学与脂质组学技术，系统分析了PCSK9单克隆抗体（mAb）联合高强度他汀治疗对急性心肌梗死（MI）患者血浆蛋白和脂质谱的影响。研究发现他汀治疗显著上调胶原调节蛋白PCOLCE，且该效应主要由肝脏介导；PCSK9 mAb在强效降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的同时，可间接降低载脂蛋白（APOE、APO C2、APO C3等），并抑制MI后脂蛋白(a)（Lp(a)）的升高，为优化动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）二级预防策略提供了新的代谢组学证据。
Abstract
背景
PCSK9（前蛋白转化酶枯草溶菌素9型）抑制是一种强效的降胆固醇策略。本研究探讨了PCSK9单克隆抗体（mAb）和高强度他汀类药物在降低低密度脂蛋白胆固醇之外的作用，这些作用尚未完全明确，特别是在急性心肌梗死（MI）患者中。
方法
研究对来自PACMAN-AMI试验的265例急性MI患者和来自维也纳脂质诊所登记的34例非MI高脂血症患者的血浆进行了联合蛋白质组学和脂质组学分析。PACMAN-AMI是一项随机、安慰剂对照的PCSK9 mAb试验。
结果
发现蛋白质组学显示，MI后PCSK9 mAb组和安慰剂组的载脂蛋白均发生变化，且前胶原C内肽酶增强子1（PCOLCE）水平升高。UK Biobank数据证实PCOLCE和PCSK9的上调与他汀类药物使用相关。肝癌细胞实验证明他汀治疗可剂量依赖性地诱导PCOLCE。靶向蛋白质组学显示，与安慰剂（仅他汀类药物）相比，PCSK9 mAb治疗导致APOB、APOE、APO C2和APO C3的降低更显著。中介分析表明，这些变化主要由LDL-C降低所解释。脂质组学发现，PCSK9 mAb治疗的MI患者中胆固醇酯、神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯的降低更为明显。在非MI患者中结果基本一致。然而，脂蛋白(a)的特征性蛋白成分LPA（载脂蛋白[a]）在PCSK9 mAb治疗的MI患者中保持不变，因为安慰剂组在MI后观察到LPA升高。
结论
MI后PCSK9 mAb治疗引起的大多数载脂蛋白变化是由LDL-C降低介导的。他汀类药物使用与循环PCOLCE增加相关，肝癌细胞实验支持其主要来源于肝脏。PCSK9 mAb联合高强度他汀可减轻MI后脂蛋白(a)的升高。
研究方法与临床队列
研究纳入两个接受PCSK9 mAb治疗的患者队列，一个为急性MI患者，另一个为脂质诊所的非MI患者。PACMAN-AMI试验获得了所有参与中心当地伦理机构的批准。维也纳脂质诊所前瞻性登记处根据《赫尔辛基宣言》建立，并获得了维也纳医科大学伦理委员会的批准。所有参与者在纳入两项研究前均签署了书面知情同意书。
UK Biobank数据分析
分析UK Biobank研究数据以评估他汀类药物使用与血浆蛋白水平之间的关联。他汀类药物和任何其他药物的使用通过UK Biobank基线治疗/药物代码数据字段20003确定。血浆蛋白质组学数据使用基于抗体的Olink Explore 3072平台测量，适用于54,219名UK Biobank参与者的亚队列。临床APO A1、APOB和Lp(a)检测用于相应Olink检测的正交验证。
实验室测量与统计分析
PACMAN-AMI患者的临床脂质参数由瑞士苏黎世大学临床化学系测量。维也纳脂质诊所患者的临床脂质参数由奥地利维也纳医科大学检验医学系测量。质谱数据集在内部获取。对质谱数据的统计分析与采集参数一起呈现。UK Biobank数据分析使用R软件进行。中介分析用于分解PCSK9 mAb对载脂蛋白和脂质参数的影响，分为直接效应和LDL-C介导的间接效应。
急性MI患者的发现蛋白质组学
在PACMAN-AMI试验中，300例急性MI患者被随机分配接受PCSK9 mAb阿利珠单抗或安慰剂联合高强度他汀治疗。完成52周随访并收集基线、4周和52周系列血液样本的265例患者的临床特征如表1所示。发现蛋白质组学显示，PCSK9 mAb组和安慰剂组在MI后4周均出现相似的血浆蛋白失调集合。两组均显示急性期蛋白（SAA4、LBP、LRG1）减少，同时红细胞蛋白（CA1和HBB）以及PCOLCE增加。有趣的是，细胞外基质成分如COMP和PRG4在PCSK9 mAb组中差异调节，而在安慰剂组中则无。PCSK9 mAb治疗还导致APOB和APOE水平比安慰剂组更大程度的降低。LPA仅在安慰剂组显示显著增加，而在PCSK9 mAb组未观察到升高。
使用UK Biobank数据分析他汀效应
为了区分新发高强度他汀治疗对血浆蛋白水平的影响与急性MI本身的影响，我们查询了UK Biobank研究的Olink蛋白质组学数据。比较他汀使用者与他汀初治者的蛋白水平发现，他汀使用者显示APO C1、APOD、APOE和APOM水平显著降低，而LPA水平较高。为分离他汀特异性效应，我们排除了同时使用其他药物的参与者，发现PCSK9是他汀使用者中最显著上调的蛋白。相反，PLA2G7、ANGPTL3、CTSB和HSD11B1在他汀使用者中显著降低。为验证在急性MI两组中观察到的PCOLCE增加，我们分析了接受他汀治疗且具有可用定量PCOLCE测量的UK Biobank参与者亚组，证实PCOLCE是最显著上调的蛋白，验证了基于质谱的发现蛋白质组学结果。
使用表达LPA的人肝癌细胞分析他汀效应
为了进一步研究他汀使用者循环LPA和PCOLCE的升高，用阿托伐他汀处理稳定表达LPA的HepG2细胞10天。递增浓度导致质谱检测到的HMG-CoA还原酶细胞内水平升高，证实了靶向活性。在条件培养基中，免疫印迹和质谱显示，响应阿托伐他汀，LPA适度增加，PCOLCE显著增加。APO A1和APOB保持不变。
通过靶向蛋白质组学在急性MI患者中验证
为了通过发现蛋白质组学验证我们的载脂蛋白发现，我们使用靶向质谱在265例急性MI患者的所有时间点定量了14种载脂蛋白。纵向数据证实PCSK9 mAb治疗的降脂效果在4周时达到峰值，与选择用于发现蛋白质组学和脂质组学的时间点一致。临床脂质测量值与基于质谱的载脂蛋白定量之间观察到强相关性，包括临床Lp(a)和LPA（Spearman r=1.0）、LDL-C和APOB（r=0.9）以及甘油三酯与APO C2、APO C3和APOE（r=0.5–0.7）。
PCSK9 mAb对临床脂质和载脂蛋白影响的中介分析
我们分析了PCSK9 mAb治疗从基线到4周对载脂蛋白和临床脂质浓度的影响。与安慰剂相比，PCSK9 mAb治疗导致LDL-C和APOB水平显著降低（-85.3% vs -52.0% 和 -73.0% vs -42.1%）。甘油三酯相关载脂蛋白（APOE、APO C2、APO C3）以及APOD、APO L1和APOM也观察到更大程度的降低。中介分析显示，与PCSK9 mAb治疗相关的大多数脂质和载脂蛋白降低完全由LDL-C降低介导。APOB、LPA和临床Lp(a)仅部分由LDL-C变化介导。在敏感性分析中包含年龄、性别、基线他汀状态和基线LDL-C等协变量并未实质性影响估计的中介效应。
PCSK9 mAb治疗在急性MI和非MI患者中的效果比较
为了在急性MI患者中验证我们的发现，我们在非MI患者中重复了质谱比较，这些患者因严重高胆固醇血症在维也纳脂质诊所前瞻性登记处接受治疗。然后我们比较了PCSK9 mAb治疗在急性MI和非MI患者中在4周时间点的效果。急性MI患者在治疗4周后比非MI患者经历更大的LDL-C和APOB中位降低（-85.3% vs -76.0% 和 -73.0% vs -54.5%）。除APOB外，甘油三酯相关载脂蛋白（APOE、APO C2、APO C3）以及APOD和APOM的降低在PCSK9 mAb治疗后的两组中均观察到。在急性MI组，甘油三酯和APO C1的基线水平可能受到肝素给药的影响，肝素影响脂蛋白脂肪酶活性。与基线至第4周的比较不同，在PACMAN-AMI伯尔尼亚队列中，在24小时至4周时间点之间观察到APO C1的降低，与非MI患者的发现一致。APO A1、APO A4和APOH在急性MI后增加，非MI队列中未见此变化。此外，虽然非MI患者显示Lp(a)和LPA降低（分别为-22.1%和-20.6%），但急性MI组在PCSK9 mAb治疗后未观察到LPA降低。
基线蛋白和脂质水平与治疗反应的相关性
APOB、APOE和LPA在PCSK9 mAb治疗4周后表现出最显著和一致的降低。为了探索治疗反应的预测因子，我们进行了基线蛋白或脂质水平与这些载脂蛋白治疗引起变化之间的Spearman相关分析。基线血浆PCSK9水平与APOB、APOE或LPA的变化无相关性。相反，基线LDL-C和临床甘油三酯水平分别与APOB和APOE的变化呈负相关。基线APOB和APOE观察到更强的负相关，表明较高的基线水平与治疗后更大的降低相关。基线临床Lp(a)和质谱测量的LPA与LPA变化呈正相关，在安慰剂组中关联显著更强。这些以及APOB/LDL-C关系是唯一显示基于Z检验的差异治疗效应的相关性。
急性MI患者中相应的脂质组学变化
为了补充我们的载脂蛋白蛋白质组学方法，我们通过比较MI后24小时和4周的血浆水平分析了脂质组学变化。一致定量了8个类别的193种脂质物种。这些脂质物种与受PCSK9 mAb治疗显著影响的载脂蛋白之间的相关性如图5所示。除LPA和APOD外，改变的载脂蛋白与胆固醇酯、神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯呈强正相关。APOD与溶血磷脂酰胆碱呈正相关，而LPA与大多数脂质物种相关性最小。酰基肉碱在MI后PCSK9 mAb组和安慰剂组均增加。与安慰剂相比，PCSK9 mAb治疗下降低最显著的是胆固醇酯，其次是神经酰胺、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、甘油三酯和甘油二酯。值得注意的是，PCSK9 mAb治疗还减弱了MI后溶血磷脂酰胆碱的升高。
讨论
我们结合蛋白质组学和脂质组学研究了PCSK9 mAb和他汀的广泛生物学效应，揭示了三个关键发现。首先，他汀治疗与LDL-C降低之外的效应相关，最显著的是胶原调节剂PCOLCE的增加，其在PACMAN-AMI试验的两个治疗组中类似升高。这通过UK Biobank数据以及涉及他汀处理肝癌细胞的体外实验得到验证，后者提示肝脏可能是循环PCOLCE水平升高的可能来源。其次，PCSK9 mAb治疗降低了甘油三酯相关载脂蛋白APOE、APO C2和APO C3。该效应在两个独立的有和无MI的队列中一致，且主要由LDL-C降低介导。第三，在安慰剂治疗的MI患者中观察到LPA升高，与基线LPA水平相关，但PCSK9 mAb组未见此现象。在他汀处理的肝癌细胞条件培养基中也观察到LPA分泌的适度增加。
他汀诱导PCOLCE增加的肝细胞贡献
急性MI队列中的发现蛋白质组学显示4周后PCOLCE水平增加，PCSK9 mAb组和安慰剂组的效应大小相似。PCOLCE增强前胶原C内肽酶的活性，该酶切割前胶原形成成熟胶原。他汀治疗促进动脉粥样硬化病变的去脂质化并导致纤维化重塑和斑块钙化，与PCOLCE增加相关。支持这一关联，我们在UK Biobank中证明他汀使用者比非使用者PCOLCE水平更高。虽然循环PCOLCE水平与心血管终点的直接证据有限，但Kolossváry等人将他汀治疗下较高的循环PCOLCE水平与非钙化冠状动脉斑块体积的更大减少联系起来。然而，在他们的研究中，循环PCOLCE的细胞来源仍不清楚。在我们的实验中，阿托伐他汀治疗导致人肝癌细胞中PCOLCE的显著、剂量依赖性诱导。综上所述，这些结果指向他汀相关的循环PCOLCE增加，可能来源于肝脏。通过促进胶原成熟，PCOLCE支持组织重塑并促进纤维化。因此，MI后心脏重塑也可能促成急性MI队列中观察到的PCOLCE升高。
UK Biobank参与者中他汀使用与蛋白水平的更广泛关联
鉴于MI后开始高强度他汀治疗，我们使用UK Biobank数据调查了他汀的更广泛效应。比较他汀使用者与他汀初治参与者证实他汀升高PCSK9水平。这强调了与PCSK9 mAb的协同作用，PCSK9 mAb抵消这种他汀诱导的PCSK9代偿性增加，从而增强其LDL-C降低效应。他汀使用者还显示ANGPTL3水平较低，ANGPTL3是一种脂蛋白脂肪酶抑制剂和已确立的ASCVD风险因素，可能有助于更大的甘油三酯降低。这与REPRIEVE试验的Olink蛋白质组学数据一致，显示他汀治疗下循环ANGPTL3较低。在后一项研究中，较高的ANGPTL3水平与主要不良心血管事件风险增加独立相关。与他汀使用者还显示PLA2G7和CTSB水平降低。虽然磷脂酶PLA2G7与ASCVD风险相关，但尚不清楚这是反映其促炎活性还是与LDL水平的相关性。在我们之前对颈动脉斑块的蛋白质组学分析中，巨噬细胞衍生的溶酶体蛋白酶包括CTSB，始终是症状患者炎症特征的突出组成部分。最后，在UK Biobank中，Olink检测未能检测到他汀使用者中预期的APOB水平降低。这一发现凸显了载脂蛋白定量中已知的跨平台差异。
甘油三酯相关载脂蛋白降低由LDL-C降低解释
与基于亲和力的检测不同，靶向质谱使用稳定同位素标记的内标直接定量肽段，消除了表位效应。鉴于PACMAN-AMI队列中广泛的载脂蛋白失调，我们应用靶向质谱发现PCSK9 mAb治疗在MI和非MI队列中均降低了APOE、APO C2和APO C3。这些主要与甘油三酯相关的载脂蛋白一直与心血管风险相关，并且在健康志愿者、无MI的高脂血症患者和近期急性冠脉综合征个体中报道了类似的变化。重要的是，我们的分析显示这些降低由LDL-C降低介导。LDL-C是一个复合测量，包含LDL、IDL和Lp(a)颗粒的胆固醇含量。观察到的载脂蛋白变化主要反映LDL和IDL颗粒的靶向减少，而非对TRL的直接、独立效应。这一解释与两项在健康、正常血脂志愿者中的动力学研究一致，证明PCSK9 mAb治疗增加LDL和IDL分解代谢并减少LDL产生。两项研究中较大的一项也报告了VLDL分解代谢增强，特别是在联合他汀治疗下。类似地，对包括高胆固醇血症患者的三项安慰剂对照2期试验的事后分析显示，不仅LDL-C及其亚组分降低，而且VLDL-C、IDL-C、APO C2和APO C3水平也降低，联合治疗下效应更大。虽然我们的脂质组学数据显示甘油三酯和甘油二酯显著降低，但这些物种在LDL和IDL中也丰富，支持增强的LDL/IDL清除的主要贡献，仅具有较小的TRL成分。由于LDL-C整合了来自多种颗粒类型的信息，载脂蛋白分析可以补充传统血脂组。在一项ODYSSEY OUTCOMES子研究中，一个9重载脂蛋白组在事件预测上优于传统血脂组，组合模型表现最佳，并额外探索了载脂蛋白用于指导PCSK9 mAb治疗选择。在我们的研究中，较高的基线APOB和APOE水平与治疗中更大的降低相关，突出了在二级预防中测量载脂蛋白的潜在价值。
急性MI后ECM和急性期蛋白失调
除了载脂蛋白和PCOLCE，其他ECM蛋白如COMP和PRG4在急性MI队列中差异调节。PRG4（润滑素）是一种糖蛋白，主要因其减少关节软骨表面之间的摩擦而被认识，仅在PCSK9 mAb组中降低。值得注意的是，PRG4与瓣膜间质细胞的成骨转化有关，这是主动脉瓣狭窄的核心过程，目前正在研究作为PCSK9抑制剂的潜在治疗适应症。PCSK9 mAb治疗下的ECM蛋白差异是否反映与单独他汀治疗不同的愈合过程值得未来研究。两个治疗组均显示急性期蛋白下调，包括LBP、LRG1和SAA4，与MI后炎症消退一致。除急性期蛋白外，载脂蛋白显示最大降低，PCSK9 mAb比高强度他汀效应更强。相反，APO A4在4周时两组均增加，与我们之前观察到的缺血/再灌注损伤后心脏ECM重塑期间APO A4上调一致。
PCSK9 mAb减弱MI后LPA和Lp(a)升高
Lp(a)是残余脂质风险的主要贡献者，UK Biobank数据显示含LPA的颗粒在每颗粒基础上比LDL更具致动脉粥样硬化性。PCSK9 mAb通常降低Lp(a) 20%至30%，但这种效应在急性MI患者中不明显。先前，我们报告了接受他汀的年轻患者从MI后即刻到1年Lp(a)升高，升高幅度取决于基线Lp(a)水平。在当前研究中，我们观察到安慰剂组从MI后期到4周类似升高，但PCSK9 mAb组未观察到。明显的Lp(a)升高可能由MI后即刻较低的基线水平解释。有人提出Lp(a)可以充当急性期蛋白，可能在血栓形成和组织修复过程中被消耗。随着炎症消退，Lp(a)水平可能恢复到MI前水平。然而，一些研究质疑Lp(a)的急性期角色，因为其MI后轨迹与高敏C反应蛋白不同。残留的低度炎症，特别是涉及白细胞介素-6（可诱导Lp(a)）可能也有助于MI后Lp(a)升高。几乎90%的急性MI患者基线时为他汀初治。MI后开始高强度他汀治疗可能升高Lp(a)水平，与我们显示阿托伐他汀处理肝癌细胞条件培养基中LPA适度诱导的体外数据一致。其他研究，包括我们来自接受低剂量阿托伐他汀的ASCOT研究参与者的质谱数据，未发现显著变化。UK Biobank中的他汀使用与LPA水平升高相关，尽管相对于他汀治疗降低LDL-C的心血管益处而言这种效应很小。关于他汀对Lp(a)效应的不同发现可能指向个体间变异性，可能受未充分探索的因素影响，如LPA翻译后修饰。我们的UK Biobank比较还揭示了Olink和临床检测对Lp(a)的差异。相比之下，我们基于质谱的载脂蛋白定量与临床测量的Lp(a)表现出近乎完美的相关性，检测到PACMAN-AMI两个治疗组中可比的倍数变化。
局限性
PACMAN-AMI试验的参与者在欧洲中心招募，限制了种族多样性。大规模PCSK9 mAb结局试验如ODYSSEY OUTCOMES显示对主要终点的治疗效果与种族之间无显著交互作用，尽管这些研究中非白人人群代表性不足。遗传变异可能通过影响基线脂质和载脂蛋白水平产生更大影响，而非差异治疗反应，例如已充分确立的Lp(a)浓度种族差异和祖先特异性蛋白数量性状位点（如APOL1）。急性MI背景下组学分析的一个关键限制是缺血事件和临床干预（如肝素给药）的潜在混杂效应。为减轻此影响，在一个亚队列中包括了MI后24小时采样时间点，并在一个独立的非急性MI患者队列中进行了验证。
结论
这项研究代表了迄今为止最大的系列血液多组学分析，检查PCSK9 mAb治疗在ASCVD二级预防中的作用。在PACMAN-AMI和UK Biobank中，我们证实了他汀相关的胶原调节剂PCOLCE增加，体外数据提示肝脏是循环PCOLCE升高的潜在来源。鉴于肝脏是他汀作用的主要部位和主要分泌器官，肝脏释放是最生物学合理的解释，尽管其他来源的贡献，即心脏细胞外基质重塑和动脉粥样硬化斑块，仍有待阐明。PCSK9 mAb和他汀的组合抵消了他汀诱导的PCSK9增加，并实现比单独他汀更大的LDL-C水平降低。这种增强的LDL颗粒减少在很大程度上介导了其他载脂蛋白的降低，包括APO C2、APO C3和APOE，首次通过中介分析显示。值得注意的是，安慰剂组观察到MI后Lp(a)升高，但接受PCSK9 mAb治疗的患者未观察到，支持其用于减轻MI后开始高强度他汀治疗患者的Lp(a)升高，直到特定的Lp(a)降低疗法在临床上可用。随着载脂蛋白在风险评估和作为治疗靶点方面的认识日益增长，未来研究应超越APOB和APOA1，以完善二级预防中的风险分层和治疗反应。
致谢
本研究使用UK Biobank资源进行，申请号为22102。
