喹喔啉衍生物DK-7：靶向UCHL5的下一代蛋白酶体抑制剂在克服硼替佐米耐药和实体瘤治疗中的突破

《Journal of Advanced Research》：Quinoxaline-based UCHL5 inhibitor as a next-generation proteasome-targeting anticancer agent beyond 20S inhibition

本研究针对传统蛋白酶体抑制剂在实体瘤疗效有限及易产生耐药的问题，开发了新型喹喔啉类小分子DK-7。该化合物通过选择性抑制19S调节颗粒中的去泛素化酶UCHL5，诱导泛素化蛋白积累、内质网应激和细胞凋亡，在体外和体内实验中显著抑制多种癌细胞（包括硼替佐米耐药的多发性骨髓瘤）生长。该研究为克服蛋白酶体抑制剂耐药提供了新策略，拓展了靶向UPS的癌症治疗前景。

在癌症治疗领域，蛋白酶体抑制剂如硼替佐米通过靶向20S核心颗粒的β亚单位，干扰泛素-蛋白酶体系统（UPS），已成为多发性骨髓瘤等血液肿瘤的重要治疗手段。然而，这类药物在实体瘤中疗效有限，且长期使用易产生耐药性，成为临床面临的严峻挑战。癌细胞依赖内质网应激反应和未折叠蛋白反应维持蛋白质稳态，但持续激活这些通路会诱导凋亡。UPS作为调控蛋白质平衡的关键系统，在肿瘤中常显著上调，因此开发新型UPS靶向策略具有迫切需求。

为突破现有局限，韩国生物科学与生物技术研究所的研究团队在《Journal of Advanced Research》发表论文，报道了一种新型喹喔啉类小分子DK-7。该化合物通过选择性抑制19S调节颗粒中的去泛素化酶UCHL5，而非传统20S蛋白酶体抑制途径，有效诱导癌细胞死亡，并在硼替佐米耐药模型中展现显著抗肿瘤活性。

研究采用报告基因筛选、酶动力学分析、生物层干涉技术（BLI）、分子对接模拟、质谱分析及异种移植模型等关键技术。其中，通过构建稳定表达内质网应激反应元件（ERSE）荧光素酶报告基因的HCT116细胞系进行初筛；利用Ub-AMC底物评估去泛素化酶活性；通过BLI分析DK-7与UCHL5的结合动力学；借助分子对接模拟揭示结合模式；并利用质谱验证共价修饰；最后在HCT116结肠癌和硼替佐米耐药多发性骨髓瘤（RPMI8226-BR）异种移植模型中评估体内疗效。

喹喔啉基DK-7通过积累泛素化蛋白诱导细胞UPR激活和内质网应激

研究人员通过ERSE荧光素酶报告基因系统筛选喹喔啉衍生物库，发现DK-7可浓度依赖性激活UPR信号（EC₅₀=3.54 μM），显著上调PERK、GRP78、ATF4、CHOP等内质网应激标志蛋白。与硼替佐米等经典蛋白酶体抑制剂类似，DK-7处理8小时即可引起总泛素化蛋白及K48连接泛素化蛋白积累，而其他内质网应激诱导剂（如衣霉素）无此效应，提示其作用机制与UPS调控相关。

DK-7特异性抑制19S蛋白酶体去泛素化酶UCHL5而不影响20S蛋白酶体活性

研究显示，DK-7对20S蛋白酶体的β1（半胱天冬酶样）、β2（胰蛋白酶样）和β5（糜蛋白酶样）活性均无抑制作用，但可浓度依赖性抑制19S蛋白酶体的去泛素化酶活性（IC₅₀=6.47 μM）。进一步实验证实DK-7选择性抑制UCHL5（IC₅₀=2.68 μM），而对USP14等其他DUB无影响。HA-Ub-VS标记实验表明，DK-7通过阻断活性位点半胱氨酸与探针结合抑制UCHL5功能。

DK-7与UCHL5活性位点直接结合

酶动力学分析显示DK-7可降低UCHL5的V_max和K_m值，提示共价结合特性。BLI实验证实DK-7与UCHL5具有高亲和力（K_D=2.70 μM），且结合后解离速率极慢。分子对接表明DK-7的炔烃基团与Cys88形成共价键，并与其他活性位点残基（如Gln82、His140）产生相互作用。对比实验显示，去除炔基的衍生物DK-7R结合亲和力下降4.15倍，且无法有效诱导泛素化蛋白积累。加入二硫苏糖醇（DTT）可完全逆转DK-7的抑制作用，进一步验证其通过半胱氨酸共价修饰发挥作用。

DK-7通过凋亡途径发挥抗癌作用

DK-7对HCT116、A549、MDA-MB-231等实体瘤细胞及多发性骨髓瘤细胞均展现显著细胞毒性（72小时IC₅₀=1.03-6.69 μM），且对正常细胞（WI-38、hPBMC）毒性较低。机制上，DK-7浓度依赖性激活caspase 3/7，上调cleaved PARP、caspase 3/7等凋亡标志蛋白。在HCT116异种移植模型中，口服DK-7（40 mg/kg）使肿瘤体积抑制率达52.8%，肿瘤组织内泛素化蛋白和cleaved caspase 3表达显著增加。

DK-7通过靶向UCHL5克服硼替佐米耐药

生物信息学分析显示UCHL5在多种癌症中高表达且与不良预后相关。在硼替佐米耐药多发性骨髓瘤细胞（IM-9-BR、RPMI8226-BR）中，DK-7仍可有效诱导泛素化蛋白积累和细胞凋亡。在耐药细胞异种移植模型中，硼替佐米治疗无效，而DK-7口服给药使肿瘤生长抑制率达56%，且不引起体重下降，组织学检测显示肿瘤内凋亡信号显著激活。

研究结论表明，DK-7作为首个喹喔啉类UCHL5选择性抑制剂，通过独特机制克服传统蛋白酶体抑制剂的局限性。其价值在于：第一，规避20S蛋白酶体抑制引发的耐药机制；第二，对实体瘤和血液肿瘤均具疗效；第三，口服生物利用度高，具有临床转化潜力。该研究为开发下一代蛋白酶体靶向疗法提供了新范式，尤其为硼替佐米耐药患者带来了希望。未来需通过结构优化和临床前研究进一步验证其应用前景。