基于八极体部花青载量子点的稳定超亮纳米探针用于双光子激发显微术

《Journal of Materials Chemistry B》：Stable ultrabright nanoprobes for two-photon excitation microscopy based on octupolar merocyanine-loaded nanovesicles

本文报道了一种新型双光子显微（2PM）纳米探针的开发，通过将具有八极对称结构的部花青染料封装于非脂质体单层量子点（QS）纳米囊泡中，显著提升染料的双光子吸收截面（σ2≈104GM）及胶体稳定性。该探针在600–700 nm波段呈现高荧光量子产率（ΦF≈23%），且通过烷基链修饰优化膜嵌入效率，在离体猪巩膜渗透实验中展现出优异的生物成像潜力，为深组织活体成像提供新策略。

　　

1. 引言

双光子显微术（2PM）凭借其深层组织成像能力和三维分辨率，已成为生物荧光成像的重要工具。然而，传统荧光染料的双光子吸收效率较低，限制了其应用潜力。本研究首次将非脂质体单层量子点（QS）纳米囊泡作为载体，负载具有中心对称结构的八极部花青染料，通过分子工程调控染料的疏水烷基链和亲水三乙二醇单元，以提升纳米载体的稳定性与光学性能。

2. 结果与讨论

2.1. 2PA纳米探针的染料设计

为实现在红色光谱区（600–700 nm）的高双光子吸收截面与强荧光发射，研究团队设计了一系列具有部花青结构的八极染料。染料的八极框架允许引入三种功能基团，分别修饰烷基链和 triglycol 链，以优化其与QS膜的相容性。

2.3. 染料4–7的光谱表征

染料4–7在600 nm附近显示强吸收带，荧光量子产率超过10%，斯托克斯位移约600 cm^?1。其发射光谱覆盖第一生物透明窗口（650–1000 nm），适用于生物成像。溶剂极性增加时，发射光谱红移约800 cm^?1，表明激发态偶极矩增大。染料在极性溶剂中的荧光寿命为0.4–0.8 ns，证实其荧光发射特性。

3. 八极部花青染料基2PA纳米探针的开发

3.1. 烷基与triglycol链对染料负载的影响

通过DELOS-SUSP法制备染料负载的QS纳米囊泡，发现含两个C18烷基链的染料5能稳定嵌入QS膜，保持单层囊泡形态（粒径≈110 nm）和高荧光亮度。而缺乏烷基链的染料7则导致囊泡形态异常（花生状）及荧光猝灭。吸收与发射光谱显示，染料5负载的QS在PBS中光学性质与游离染料在乙醇中相似，表明膜封装有效保护了染料性能。

3.2. 染料负载量对纳米探针亮度的影响

研究比较了低（1 μM）、中（7 μM）、高（36 μM）三种染料负载量的QS制剂。随着负载量增加，单颗粒亮度提升至10⁷M^?1cm^?1量级，但荧光量子产率从23%降至3%，归因于染料聚集引起的非辐射猝灭。双光子吸收截面在910 nm处达300–800 GM，显著高于常用染料（如荧光素）。纳米囊泡的胶体稳定性在8个月内未发生显著变化。

4. 纳米探针在猪巩膜组织中的2PM评估

离体实验显示，染料5负载的QS在猪巩膜表面产生强红色荧光信号，而游离染料因水性环境中聚集而信号微弱。二次谐波成像（SHG）证实纳米探针与胶原纤维无显著相互作用，但受限于QS的大尺寸（>100 nm）及巩膜基质电荷作用，深层渗透有限。在疏水性猪皮肤实验中，QS与游离染料均能有效渗透，印证染料的强亲脂性。

5. 结论

本研究成功开发出基于八极部花青染料的稳定2PM纳米探针，通过分子设计与纳米载体工程结合，实现了高亮度（单颗粒亮度≈10⁴GM）、宽谱双光子吸收及长效胶体稳定性。该探针在生物组织中保持光学性能，为活体成像应用提供了新平台。

6. 材料与方法

QS纳米囊泡由胆固醇（CHOL）、肉豆蔻基氯化铵（MKC）和CHOL-PEG2000通过DELOS-SUSP法制备，染料通过疏水作用嵌入膜结构。光谱学表征采用UV-Vis、荧光寿命测试及双光子激发光谱分析；形貌通过冷冻透射电镜（cryo-TEM）确认。离体实验使用猪巩膜及皮肤组织，通过2PM系统评估探针渗透性与信号稳定性。