寄主诱导的立枯丝核菌5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶沉默削弱其在水稻中的致病性

《Plant Biotechnology Journal》：Host-Induced Silencing of Rhizoctonia Solani 5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase Impairs Its Virulence in Rice

本文系统解析了水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani AG1-IA）通过莽草酸途径（Shikimate pathway）关键酶RsEPSPS介导的致病机制，首次证实利用寄主诱导基因沉默（HIGS）靶向该酶可显著抑制病原菌生长与侵染，为作物抗病育种提供了新靶点。

　　

2.1 基于显微解剖分析的水稻纹枯病菌侵染阶段解析

通过对比感病水稻品种PR114-S（PR114）与中度抗病种质ShB-R（ShB8）接种立枯丝核菌AG1-IA后的病理变化，发现接种96小时后，PR114-S叶片鞘部坏死面积和真菌生物量显著高于ShB-R。共聚焦显微镜观察显示，病原菌在24小时可侵入两种基因型水稻，但在48小时和72小时后，PR114-S中的菌丝生长更旺盛，细胞死亡范围更广。病原菌侵染进程可分为定殖初期（24 hpi）、定殖后期（48 hpi）和坏死阶段（72 hpi）。

2.2 立枯丝核菌AG1-IA侵染过程中转录组数据质量与差异分析

对19个样本进行RNA测序，共获得183.9 GB数据，平均每个文库产生3638万条高质量 reads。差异表达基因（DEG）分析显示，在ShB-R中，24、48、72 hpi分别有1120、1667、1772个基因表达发生显著变化（|log₂FC| ≥ 2 或 ≤ -2，p ≤ 0.05），其中上调基因数分别为451、835、868个，下调基因数为669、832、904个。而在PR114-S中，三个时间点分别有1691、1354、1515个DEG，其中上调734、618、804个，下调957、736、711个。韦恩图分析揭示两个水稻基因型中共同表达的DEG有790个，且各时间点存在阶段特异性表达基因。GO富集分析表明，病原菌在侵染过程中调控了细胞组分、分子功能及生物学过程相关基因的表达。

2.3 细胞壁重塑、转录调控、转运与信号相关基因的表达失调

病原菌分泌多种植物细胞壁降解酶（PCWDEs），包括糖苷水解酶家族GH5、GH9等，其中GH5与GH9在侵染过程中持续上调，可能参与宿主细胞壁分解。几丁质脱乙酰酶、外切β-1,3-葡聚糖酶等细胞壁修饰酶也显著上调。此外，3个ABC转运蛋白、1个C4-二羧酸转运蛋白及多个细胞色素P450、GMC氧化还原酶表达下调，暗示其可能在逃避宿主免疫反应中起作用。27个锌指转录因子（包括Zn2Cys6、Cys2His2等类型）、5个F-box蛋白、2个WD40蛋白及12个蛋白激酶等调控因子在侵染过程中差异表达，提示其在病原菌致病过程中起关键协调作用。

2.4 麦角固醇与莽草酸合成途径基因在致病过程中差异表达

KEGG通路分析显示，麦角固醇和莽草酸合成途径在病原菌侵染过程中显著失调。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（AG1IA_00127）在72 hpi上调6.2倍，促进戊糖磷酸途径代谢流。而麦角固醇合成关键酶基因（如HMG-CoA合酶、角鲨烯环氧酶、羊毛固醇合酶等）均显著下调。相反，莽草酸途径基因（包括磷酸-2-脱氢-3-脱氧庚酮酸醛缩酶、3-脱氢奎宁酸合酶、莽草酸脱氢酶、RsEPSPS、分支酸合酶、苯丙氨酸解氨酶等）在侵染过程中持续上调，实时荧光定量PCR结果与转录组数据一致。

2.5 抑制莽草酸途径可阻碍病原菌生长与致病性

草甘膦（EPSPS抑制剂）处理显著抑制立枯丝核菌AG1-IA的菌丝生长，1 mM、2 mM、5 mM草甘膦分别导致菌丝生长抑制达50%、50%和78%。用5 mM草甘膦处理菌核后接种水稻，病原菌致病力明显减弱，真菌生物量显著降低。此外，草甘膦对稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、交链孢菌（Alternaria alternate）、平头刺盘孢菌（Colletotrichum truncatum）和禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）等其他植物病原真菌也有生长抑制效果，抑制率最高达51%，表明莽草酸途径是广谱抗真菌靶标。

2.6 RsEPSPS的草甘膦结合位点与植物及其他病原真菌不同

系统发育分析显示，RsEPSPS与水稻EPSPS相似度仅39%，且不聚为一类。分子对接表明，草甘膦与RsEPSPS结合涉及Gly337、Met338、Arg339、Gly340、Ala341、Gly342、Lys343、Thr344、His345、Asp360、Asp362、Ser407、Thr408、Gly409、Gly410等残基，其中Gly340与Gly342在多种植物病原真菌中保守，而与水稻EPSPS的Gly172、Thr173、Pro177等结合位点不同。

2.7 草甘膦通过直接结合抑制RsEPSPS酶活

原核表达并纯化获得约54 kDa的RsEPSPS重组蛋白。酶活实验显示，50 mM草甘膦可抑制92.89%的RsEPSPS活性，IC₅₀值为9.15 ± 0.18 mM。热迁移实验（thermofluor assay）进一步证实草甘膦与RsEPSPS结合后，其熔解温度（T_m）从63°C升至77°C（5 mM草甘膦），表明二者形成稳定复合物。

2.8 本氏烟叶片中瞬时表达RsEPSPS RNAi可削弱病原菌侵染能力

选取400 bp RsEPSPS特异性片段（与水稻、本氏烟EPSPS无显著同源性）构建RNAi载体，荧光标记dsRNA证实立枯丝核菌可吸收环境中的dsRNA。在本氏烟叶片中瞬时表达RsEPSPS RNAi后接种病原菌，发现病害斑面积减小，真菌生物量显著下降，RsEPSPS表达水平上升，表明HIGS有效沉默靶基因并增强植物抗病性。

2.9 寄主诱导的RsEPSPS基因沉默可增强水稻抗病性且不影响农艺性状

获得11株转RsEPSPS RNAi的水稻（品种Kittake）T₀代植株，经PCR验证筛选出L-4、L-6、L-8三个稳定表达株系。接种病原菌后，转基因植株中菌丝生长和穿透能力显著受限，RsEPSPS转录水平下降51%–56%，真菌生物量减少95.54%–97.38%。此外，转基因株系在株高、穗长、每穗粒数、粒重等农艺性状上与对照无显著差异，说明HIGS策略在抗病育种中具有应用潜力。

3 讨论

本研究首次系统阐明立枯丝核菌AG1-IA通过调控莽草酸途径关键酶RsEPSPS表达以增强其致病力。草甘膦抑制及HIGS实验均证明靶向该酶可有效抑制病原菌生长与侵染。莽草酸途径作为真菌次级代谢产物合成的重要来源，其调控网络在病原菌—寄主互作中具有保守性与特异性，为开发新型抗病作物提供理论依据。

4 结论

莽草酸途径是立枯丝核菌AG1-IA致病的关键靶标，利用HIGS沉默RsEPSPS可显著提高水稻对纹枯病的抗性，且不引起农艺性状损失，为作物真菌病害防控提供了新策略。

5 材料与方法

包括病原菌与植物材料培养、显微观察、RNA提取与测序、基因表达与功能验证、蛋白纯化与活性分析、HIGS载体构建与遗传转化、统计分析方法等详细实验流程，确保结果可重复性与科学性。