《Nanoscale》：Mechanism of polypeptide translocation through gold nanopores in view of sequencing applications
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本文从分子动力学模拟和实验验证的角度，深入探讨了多肽在金纳米孔中的穿行行为，为无标记光学测序（如表面增强拉曼散射SERS）技术提供了关键理论支持。研究揭示了静电排斥是决定多肽延伸的主要因素，离子类型（Li+, Na+, K+）而非离子强度对其延伸有更显著影响。研究者阐明了肽-孔相互作用在促进多肽延伸、减缓其穿行速度中的作用，并提出了一种可由横向电场调控的“走走停停”（stop-and-go）穿行机制。该机制结合适宜的离子使用，有望为实现单氨基酸分辨率的光学检测提供控制策略。
1. 引言
对肽和蛋白质一级结构的测序在蛋白质组学及其医学应用中至关重要。纳米孔传感技术作为一种高灵敏度、多功能的研究手段受到广泛关注。然而，基于光谱学（如SERS）的无标记蛋白纳米孔测序技术仍面临两大关键挑战：如何使蛋白质适当展开以实现氨基酸顺序通过纳米孔并被清晰读取，以及如何控制蛋白质在孔中的运动（特别是穿行速度）。为控制穿行动力学，必须深入理解蛋白质穿行机制及其对孔结构、外部电场和环境条件的依赖性。这促使了理论与实验研究的发展，特别是分子动力学模拟在探究分子穿行决定因素中的作用日益重要。本文旨在通过分子动力学模拟，直接研究聚谷氨酸在溶液中及金纳米孔内的动力学，重点关注多肽穿行机制及其在测序应用中的调控策略。
2. 方法
本研究通过经典分子动力学模拟，分析了由10个谷氨酸残基组成的多肽与不同抗衡离子、在不同离子强度、是否存在金纳米孔及不同静电场条件下的相互作用。模型系统使用PeptideBuilder软件构建肽段。金纳米孔设计为正二十棱柱的侧面形状，内表面为Au(111)，直径约为5.6纳米。模拟使用GROMACS软件包，采用OPLS-AA力场描述相互作用，水分子采用SPC模型，金纳米孔与溶液系统的相互作用使用GolP力场描述。通过分析均方根偏差、回转半径、溶剂可及表面积等结构描述符，以及肽段质心的穿行速度，探究了肽的结构动态和穿行行为。实验部分采用离子束刻蚀法制备了最小内径为10纳米的固态金纳米孔，研究了5000个单元的聚谷氨酸分子在氯化钾溶液中的电泳穿行，并通过电流脉冲分析了穿行时间。
3. 结果与讨论
3.1. 游离肽的结构动力学
在不施加电场和无纳米孔的情况下，模拟显示肽在溶液中呈无规卷曲结构，与初始的α螺旋结构相比明显伸长。这种伸长主要由带负电的羧基之间的静电排斥驱动，并受到水和抗衡离子的部分屏蔽。
3.2. 离子-肽相互作用
离子种类对肽结构有显著影响。与Na+和K+相比，Li+离子由于尺寸小，能与肽的羧基更紧密地结合，从而更有效地屏蔽了羧基间的静电排斥，导致肽采取更紧凑的构象。离子强度对肽延伸的影响相对较小，但会影响肽在静电驱动场下的穿行速度。更高的离子强度会增强离子对肽电荷的屏蔽效应，并增大对肽运动的阻力，从而减缓其穿行速度。
3.3. 外场驱动下的肽动力学
施加沿纳米孔轴方向的静电场可驱动肽穿行。在无孔情况下，肽的穿行速度与电场强度近似呈线性关系，并随离子强度的增加而降低，在Li+溶液中速度最慢。该结果表明，可通过改变离子种类、强度及驱动场强度来调控穿行速度。
3.4. 纳米孔内的肽穿行动力学
当肽被限制在金纳米孔内时，与孔表面的相互作用使其倾向于吸附在孔壁上。这种吸附作用使肽结构更加刚性且保持伸长状态，有利于其测序。同时，吸附也起到了摩擦作用，显著减慢了肽的穿行速度。通过控制纳米孔表面的横向电势差，可以调节肽与孔壁的相互作用强度。当横向电势差增加到一定程度（如220毫伏）时，肽的穿行呈现出一种“走走停停”的机制：肽会周期性地被吸附在孔壁上，然后在电场作用下挣脱并向前移动一段距离。这种机制为实现可控的、适合单氨基酸检测的穿行速度提供了可能。
3.5. 实验验证
实验研究了5000个单元的聚谷氨酸在金纳米孔中的穿行。在1毫伏/纳米的驱动场下，测得的平均穿行速度为1.25 × 10-3米/秒。该速度介于模拟预测的横向电势为210和215毫伏之间的穿行速度范围内，表明“走走停停”机制在实验体系中可能是存在的。理论与实验结果的差异源于模型系统与真实系统在肽长度、纳米孔尺寸、离子环境等方面的不同。
3.6. 氨基酸可区分性
分析氨基酸残基在穿行方向上的空间重叠表明，纳米孔的存在显著提高了氨基酸的可区分性。在孔内，肽倾向于沿孔轴延伸，相邻谷氨酸残基侧链的重叠度显著降低，从而使单个氨基酸残基的检测成为可能。
4. 结论
本研究为利用金属纳米孔进行无标记光学蛋白测序提供了原子层面的机制理解和调控指导。核心发现包括：离子类型是控制肽延伸和穿行行为的关键因素之一；Na+和K+等离子结合横向电场可有效调控肽穿行；在金纳米孔中，肽-孔相互作用和可控的横向电势可诱导“走走停停”的穿行机制，为精确调节穿行速度以实现氨基酸级光学检测开辟了道路。这些发现对于优化固态纳米孔设计和控制蛋白质测序实验参数具有重要的指导意义。
