综述：DNA靶向入侵探针：发现、原理与应用

《RSC Chemical Biology》：DNA-targeting Invader probes: discovery, principles and applications

本综述系统阐述了Invader探针的发现历程、作用原理及应用前景，该双链寡核苷酸探针通过2′-N-(芘-1-基)甲基-2′-氨基-α-LNA单体（L）等构建的"能量热点"实现双链DNA(dsDNA)的序列非依赖性识别。重点解析了探针设计（如+1链间拉链排列）、热力学驱动机制（ΔGrec优化）及在非变性荧光原位杂交(nd-FISH)等领域的应用突破，为遗传病诊疗提供了新工具。

　　

DNA靶向Invader探针的研发历程

开发能够特异性识别双链DNA(dsDNA)区域的化学修饰寡核苷酸、核酸模拟物和蛋白构建体，是持续受到高度关注的研究领域。该领域的发展动力源于对遗传病诊断试剂、基因表达调控剂和创新疗法的迫切需求。与传统通过DNA双链沟槽识别核苷酸特征的方法不同，近年来出现了一类链入侵探针，这类探针能够通过打破现有Watson-Crick碱基对、形成更稳定的新碱基对来实现与dsDNA的结合。

发现Invader原理

在20世纪90年代末至21世纪初，Wengel教授实验室在对构象限制性和亲和力增强的锁核酸(LNA)及α-L-LNA单体进行开创性研究后，开始关注功能化寡核苷酸在核酸埃尺度工程中的应用。这推动了对N2′-功能化2′-氨基-LNA和2′-氨基-α-L-LNA单体的研究兴趣，其中2′-氮原子取代氧原子允许引入如芘荧光基团等精确定位的附加基团。

首例Invader构建单元——2′-N-(芘-1-基)甲基-2′-氨基-α-L-LNA胸苷单体(L)的合成历经18步反应，总产率约3%。关键步骤包括：C2-叠氮基团的引入、Vorbrüggen糖基化反应产生不可分离的α/β核苷异构体混合物、后续α-L-核糖和β-L-核糖构型双环核苷中间体的分离、以及防止C2′-氨基与胸腺嘧啶C6位发生分子内迈克尔加成的保护基选择。

初步表征显示，单个L单体修饰的9聚体寡核苷酸与互补DNA(cDNA)形成的双链具有异常高的稳定性，熔解温度(T_m)提升高达+15.5°C。相比之下，α-L-LNA-T或未功能化2′-氨基-α-L-LNA-T单体的ΔT_m值分别为+8.0°C和+2.5°C，表明芘基团在双链稳定中起着显著作用。而2′-N-乙基-2′-氨基-α-L-LNA胸苷单体（即用甲基取代芘）则导致DNA双链严重 destabilization (ΔT_m低至-12.0°C)，进一步证实了芘基团的稳定作用。

这种稳定作用归因于嵌入的芘基团与侧翼碱基对之间形成的强π-π堆积相互作用。L修饰的寡核苷酸表现出显著的DNA选择性，即与互补RNA(cRNA)形成的双链稳定性远低于与cDNA形成的双链。此外，与未修饰的寡核苷酸相比，L修饰的寡核苷酸对芘修饰单体对面错配核苷酸的区分能力降低，这可能是因为嵌入芘基团与侧翼错配碱基对之间的强堆积相互作用补偿了扭曲碱基对导致的稳定性损失。

分子建模研究表明，单体L的核碱基和芘基团的连接点由于刚性的2-氧代-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷骨架和连接芘的短亚甲基链而相互制约，这促进了核碱基和芘基团之间的π-π堆积，使其预组织为嵌入构型。

定义关键术语

本文将描述的+1链间芘功能化核苷酸单体（更广义地讲，是+1链间嵌入剂功能化核苷酸单体）的结构基元称为"能量热点"。含有一个或多个能量热点的寡核苷酸双链探针称为"Invader探针"。特别地，含有一个或多个L单体能量热点的Invader探针称为"Invader LNA探针"。

初始dsDNA识别实验

含有单个L单体+1链间拉链的预退火9聚体Invader LNA探针，与等量或两倍过量的预退火未修饰DNA双链（混合序列，与探针互补）在室温下孵育，可观察到芘激基缔合物信号的快速消失（<1分钟），表明Invader LNA探针已解离形成两个相应的探针-靶标双链。实验在T_m缓冲液（模拟生理盐度：[Na⁺] = 110 mM）中进行，温度显著低于Invader LNA探针、dsDNA靶标或任何成功识别后可能形成的探针-靶标双链的T_m，表明识别过程可能通过顺序置换（链入侵）过程而非简单的解离（链交换）过程进行。相反，将Invader LNA探针与等量的在探针相对位置有一个或两个序列差异的9聚体DNA双链孵育，仅导致激基发射的微小减少。

第二代Invader探针

由于首批N2′-芘功能化2′-氨基-α-L-LNA亚磷酰胺单体的合成复杂且供应有限，研究重点转向寻找和获取更易得的N2′-芘功能化2′-氨基-α-L-LNA单体的结构和功能类似物。文献调研指出2′-O-(芘-1-基)甲基核糖核苷(X)和2′-N-甲基-2′-N-(芘-1-基)甲基-2′-氨基脱氧尿苷(Y)单体是潜在候选物。

针对单体X和Y亚磷酰胺的合成路线被开发出来。对于X单体，利用三烷基硼酸介导的O2,O2′-脱水尿苷开环反应，使用1-芘甲醇在无水DMSO中反应，以中等但稳定的产率得到O2′-芘功能化的关键中间体，随后进行O5′-二甲氧基三苯甲基化和O3′-亚磷酰胺化，从尿苷出发五步总产率约12%。对于Y单体，改进的合成路线以5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-氨基-2′-脱氧尿苷为起始原料，通过连续还原胺化反应，先引入大的N2′-取代基，再引入N2′-甲基基团，改进的O3′-亚磷酰胺化使得从尿苷出发六步总产率提高至约52%。

表征显示，X或Y修饰的寡核苷酸与cDNA形成的双链稳定性仅略低于相应的L修饰双链，但高于相应的O（α-L-LNA-T）和N（未功能化2′-氨基-α-L-LNA-T）修饰双链。含有X或Y单体不同链间拉链排列的DNA双链的热变性特征与相应的L修饰双链高度相似。特别是，含有X或Y单体+1拉链的DNA双链同样不稳定，并表现出显著的芘激基发射信号，表明芘基团具有相似的结合模式，即在探针-靶标双链中发生稳定的嵌入，而在具有+1拉链的DNA双链中产生不稳定的干扰并违反最近邻排斥原则(NNEP)。

建立第二代Invader探针的设计规则

能量热点的核碱基组成影响Invader探针的稳定性和dsDNA识别效率。研究表明，由2′-O-(芘-1-基)甲基-RNA嘧啶单体（靶向5′-CA/CG/TA/TG-3′步骤）组成的热点探针显示出最显著的dsDNA识别驱动力，因为当3′侧是嘌呤时，形成的探针-靶标双链非常稳定。相反，由2′-O-(芘-1-基)甲基-RNA鸟嘌呤单体组成的热点效果较差，当3′侧是胞嘧啶时，单个探针链显示出较低的cDNA亲和力。

广泛修饰的第二代Invader探针显示出改善的dsDNA识别特性。含有多个能量热点（修饰密度高于25%）的Invader探针能更有效地识别模型dsDNA靶标。这归因于随着修饰密度的增加，单个探针链的cDNA亲和力增加，而不是Invader探针的额外去稳定化。识别似乎不受靶区域GC含量的实质性限制，已证明可识别GC含量高达~70%的模型dsDNA靶标。然而，由于Invader探针的热点优选由芘功能化的嘧啶单体构建，这要求dsDNA靶区域具有高密度的5′-嘧啶-嘌呤步骤。

识别动力学、结合特异性和入侵机制

含有多个连续X或Y热点的13聚体Invader探针在室温下，以200倍过量孵育时，可在数十分钟至数小时内完成50%的DNA发夹靶标入侵。增加修饰密度不仅导致更大程度的dsDNA识别，而且识别速度更快。一旦形成，包含高度修饰Invader探针的入侵复合物非常稳定，即使存在大量竞争靶标，24小时内仍能大部分保持完整。

Invader探针以高特异性结合dsDNA区域。含有第二代单体的Invader探针能完全区分在相对于探针的一个或两个位置上序列不同的DNA发夹，显示出对具有约94%序列同源性的dsDNA区域的出色区分能力。这种高结合特异性可能源于"严谨性钳制"效应：Invader探针的双链二级结构比与正确靶标形成的识别复合物稳定性差，但比与错配靶标形成的相应复合物更稳定，从而选择性阻碍非靶标结合，放大靶标与非靶标相互作用之间的热力学区分。

提出的Invader探针介导的dsDNA识别机制推测为：密集修饰的Invader探针部分变性且显著扰动，使得芘基团能够初始非特异性地相互作用并嵌入到DNA双链特别易接近的区域。这可能启动Watson-Crick碱基对的成核和解链，最终通过类似于假互补PNA的双双链入侵机制识别互补的dsDNA区域。

Invader探针的应用

在概念验证实验中，基于Invader捕获和信号探针的96孔板夹心法检测被开发用于识别三种食源性病原体（鼠伤寒沙门氏菌、空肠弯曲菌和大肠杆菌）的特异性混合序列dsDNA区域。该检测在37°C孵育1小时后，显示出20-55 pM的靶标灵敏度，并具有高特异性。

在非变性荧光原位杂交(nd-FISH)实验中，Cy3标记的Invader探针成功用于识别牛雄性肾细胞系固定细胞核中Y染色体上高度重复DYZ-1卫星区域的特异性位点。探针在38.5°C、非变性条件下孵育3小时后，在异染色质区域产生单一的、 punctate 荧光信号，与DYZ-1卫星靶标的预期定位一致。在中期核中，每个核观察到一或两个定位信号。预处理实验证实DNA是Invader探针的靶标。对照实验（使用雌性细胞核、非靶向探针或未修饰DNA双链）均未产生定位信号，证明了识别的特异性。针对端粒DNA（脊椎动物中为5′-TTAGGG-3′重复序列）的Invader探针也在nd-FISH实验中成功应用，在大多数中期染色体的末端产生成对的明亮焦点。

结论与未来展望

Invader探针的研究始于对改进LNA类似物的好奇驱动探索，最终意外发现含有+1链间嵌入剂功能化核苷酸拉链的DNA双链是不稳定的，而单个链对互补DNA表现出显著亲和力。这一偶然发现催生了一类新的链入侵探针，能够实现dsDNA靶区域的序列非依赖性识别。

虽然关键证据已支持Invader探针的实用性（尤其是在nd-FISH条件下靶向特定染色体DNA区域的能力），但仍有许多领域有待探索。在细胞培养中证明有效的核摄取和基因敲低将为确立Invader探针作为解决稳健、序列非依赖性dsDNA识别这一长期挑战的方案提供重要证据。其他潜在应用包括作为富集稀有突变体的PCR阻断剂、人工限制性内切酶以及非蛋白质基础的基因编辑构建体。

总之，Invader探针表明，定向嵌入可以被用来克服双链入侵的能量惩罚，从而实现不依赖蛋白质的、序列非限制性的双链DNA访问。