《Sustainable Food Technology》：Sustainable development of pellucid bio-slides from discarded fish scales for microscopy imaging
可持续发展聚焦
本研究通过将废弃鱼鳞生物废料转化为功能性生物载片，提出了一种可持续且可生物降解的替代方案，其光学和机械性能与商业玻璃相当，通过整合生物废料增值、绿色材料设计和安全创新，为更绿色的科学生态系统提供支持。
1 引言
显微技术是医院、诊断和研究实验室中不可或缺的成像技术，用于高分辨率可视化结构和复杂的细胞及生理过程。其应用涵盖细胞生物学、微生物学、材料科学和病理学等多个领域，其中从常规光学显微镜到荧光、共聚焦和受激发射损耗（STED）等先进显微镜已成为阐明亚细胞动力学、生物结构、病理条件以及推动微生物学、诊断和生物医学创新的关键工具。
玻璃载片虽然广泛使用，但存在几个紧迫的局限性，可能影响成像质量和实验结果。此外，玻璃在特定成像条件下可能显示自发荧光，导致背景噪声和信噪比降低。玻璃的耐化学性也有限，因为某些溶剂或试剂可能导致玻璃表面蚀刻或降解，使成像困难。此外，反复清洗和重复使用会导致表面划痕，随着时间的推移降低样品粘附性和光学性能。最重要的是，其固有的脆性和锋利的边缘使它们极易破裂和意外刺穿，对临床医生构成巨大风险。
优选地，从生物废料中获取功能材料符合保护绿色和蓝色经济的可持续发展目标（SDGs）。生物支架固有地表现出适合特定应用的特性，使其在可持续材料开发中极具吸引力。在这些生物废料中，鱼鳞因其引人注目的光学、半吸收性、机械、金属结合、氧化还原和电子特性而脱颖而出，这些特性源于其胶原化学组成。这些特性使其能够用于多种应用，包括电视显示器、压电纳米发电机、重金属修复、伤口愈合、低体积光谱学和自降解假体植入物。
本文提出鱼鳞废料作为显微术的可生物降解生物载片，利用其固有的透明度（超过82%）、亲水性和优异的样品保留能力。由于传统光学显微镜针对标准玻璃载片进行了优化，我们制造了一个定制的、可重复使用的3D打印适配器，以将我们的生物载片安全地容纳在显微镜载物台上。生物载片在激光激发下表现出出色的结构完整性，并对常见染料和标记剂具有卓越的兼容性，从而促进了细胞和组织的高分辨率共聚焦成像。
2 材料与方法
2.1 材料
使用来自当地鱼市的罗胡鱼（Labeo rohita）鱼鳞，平均直径约12-18毫米。染色染料购自Himedia Ltd India。大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）购自微生物培养物保藏中心，CSIR-NCL，浦那，印度。所有其他化学品和试剂均来自标准商业来源，并具有最高可用质量。
2.2 动物实验
C57BL/6NCrl小鼠从Hylasco Biotechnology Pvt. Ltd, Hyderabad, India购买。小鼠在海得拉巴大学中央动物设施中饲养，光照/黑暗周期为12小时，随意提供食物和水。本研究中使用的小鼠是另一实验的一部分（3R原则）。所有动物实验均根据机构动物伦理委员会（IAEC）批准（UH/IAEC/MGB/2023-1/05）并在印度动物实验控制与监督委员会（CPCSEA）的规定下进行。
2.2.1 组织灌注、固定、冷冻包埋和切片
动物用氯胺酮和甲苯噻嗪混合物深度麻醉，并经心灌注1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后灌注4%多聚甲醛（PFA）。脊髓被解剖并在4% PFA中于4°C额外固定2小时。固定后，脊髓组织在室温下用1×PBS轻轻洗涤3次，每次2小时。然后将组织转移到20%蔗糖溶液中，并在4°C下孵育，直到组织完全下沉。最终，小心剥离脊髓根，腰段使用OCT化合物在Peel-A-Way包埋模具中包埋。块体使用液氮（N2）冷却的异戊烷冷冻，并储存在-80°C直至使用。从制备的脊髓冷冻块中，使用Leica冰冻切片机获得脊髓切片（20微米和30微米），并将切片直接收集到硝化纤维素涂层的生物载片上。载片储存在-20°C或4°C直至使用。
2.2.2 免疫组织化学
将带有组织切片的生物载片放入12孔板中（每孔一个切片），并进行免疫组织化学处理。带有脊髓横截面的生物载片用1×PBS洗涤三次（每次洗涤10分钟）。然后将切片在4°C下与一抗（抗NeuN抗体1:200稀释；cat. #MAB377 Chemicon）在封闭液（2% BSA, 0.5% Triton X-100 in 1×PBS）中孵育过夜。与一抗孵育后，带有切片的生物载片用1×PBS洗涤三次（每次洗涤10分钟）。然后切片与Alexa 555标记的二抗（山羊抗小鼠IgG1）在室温下孵育2.5小时。孵育后，切片用1×PBS洗涤三次（每次洗涤10分钟）。然后将切片用玻璃盖玻片（封片剂为50%甘油 in 1×PBS）封片，并通过将其放置在定制的3D打印适配器中准备共聚焦显微镜观察。对于常规荧光显微镜，我们使用了快速的免疫组织化学方案。所有用1×PBS的洗涤与上述共聚焦显微镜的方案相似。与一抗的孵育在32°C下进行5小时，二抗为2小时。最终PBS洗涤后，切片用Mowiol作为封片剂用玻璃盖玻片封片，并在Nikon Eclipse Ti2显微镜上成像。
2.3 从废弃鱼鳞中增值透明生物载片
鱼鳞首先用Milli-Q水轻轻擦拭以去除表面粘多糖和其他碎屑。然后进行顺序蚀刻过程，包括在50 mL 1 M NaOH中以200 rpm摇动，随后在室温下用50 mL 10% HCl处理1小时，以实现脱矿质和脱细胞。之后，将鳞片在Milli-Q水中浸泡过夜以进一步纯化，然后风干24小时以获得透明鳞片。在每个处理阶段后，鳞片用Milli-Q水彻底冲洗，并施加轻度摩擦。在达到超过82%的透光率后，将鳞片均匀切割成1厘米×1厘米的片，此后称为“生物载片”，并储存在密封、气密的容器中直至将来使用。
2.4 评估生物载片的透明度、表面结构和润湿性
为了评估光学透明度（吸光度和透光率），使用多扫描天空分光光度计（Thermo Scientific, California, USA）记录生物载片的UV-vis光谱，操作波长为1纳米分辨率。使用我们之前开发的定制适配器来安全定位生物载片，以进行薄膜的精确测量。
使用安装有Magcam MU2A相机的Olympus显微镜CKX53（Olympus, Tokyo, Japan）进一步评估生物载片的光学透明度和表面形态外观。
通过滴铸5微升静滴使用接触角测角仪（HO-IAD-CAM-01, Holmarc, India）进行生物载片的静态和时域润湿性测量。接触角值从录制的视频中使用ImageJ软件通过滴形分析获得。所有测量至少进行三次以确保可重复性。
使用万能试验机（2D Strain Master-LaVision, Germany）测量拉伸强度，具有100 N载荷传感器和1 kN的框架容量，十字头速度为6毫米/分钟。
2.5 可重复使用的生物载片支架的设计和3D打印
生物载片为1厘米×1厘米的可消耗片，被安装到一个可重复使用的类似载片的支撑物中，该支撑物中间有一个保持槽，使用聚乳酸材料通过3D打印机制造。
2.6 在生物载片上可视化细菌
作为概念验证，首先使用地球上最小的生物评估生物载片的载片可比成像潜力。简言之，将两种形态的细菌各5微升；杆状（大肠杆菌）和球状（金黄色葡萄球菌），光学密度为0.6，放置在生物载片中间，使用移液器尖端轻轻涂抹以风干。生物载片立即放置在载片支架的槽中，将其安装到显微镜载物台上以在不同放大倍数下成像。
2.7 利用生物载片成像生物源宏观结构和组织切片
对于实时显微镜观察，将各种样品的5微升各样品，包括横切植物叶和茎、花粉和真核细胞（HeLa和MBA-MB-231细胞系），分别放置在生物载片中间，使用尖端轻轻涂抹，并使用镊子将生物载片小心地放在载片支架的槽上，同时使液滴朝上适合显微镜检查。
2.8 生物载片的染色兼容性
使用生物载片革兰氏染色测定法进行生物载片的染色兼容性测试。首先，将5微升细菌在生物载片上风干以形成细菌涂片。然后，用结晶紫淹没生物载片，随后用革兰氏碘固定初级染色。接下来，我们应用脱色剂从革兰氏阴性细胞中去除染料。最后，应用复染剂藏红将脱色细胞染成粉红色，从而在干燥后在显微镜下观察紫色革兰氏阳性和粉红色革兰氏阴性细菌。
2.9 显微镜检查和图像量化
通过成像免疫染色的小鼠脊髓横截面在共聚焦显微镜（LSM 710, Carl Zeiss, Germany）上评估我们的生物载片对激光共聚焦显微镜的兼容性评估，在明场模式下定位感兴趣区域。一旦区域对焦，系统切换到共聚焦模式。仔细调整成像参数，如针孔大小、激光功率、光电倍增管增益和信号偏移，以优化图像质量并最小化光漂白和信号饱和。使用适用于Alexa 555的激光激发顺序扫描切片以捕获高分辨率荧光图像。切片也在透射光显微镜视野下可视化。所有图像使用Carl Zeiss软件在不同放大倍数下捕获。常规荧光成像在Nikon Eclipse Ti2显微镜上进行。对于自发荧光强度测量，使用相似的增益和曝光设置进行图像采集。使用Fiji软件进行图像量化。所有量化均在原始图像（.nd2文件）上进行。
3 结果与讨论
生物基质固有地具有多样的结构和功能属性，当经过深思熟虑地调整后，可以转化为对人类有益的有用应用。利用鱼鳞的自然透明度和亲水性，本研究将废弃鱼鳞的增值扩展到用于显微镜成像的透明生物载片。这项创新开创了传统玻璃载片的可持续替代品，传统玻璃载片由于其脆性和锋利边缘，容易破裂和意外伤害，通过意外切割导致疾病（乙型肝炎、人类免疫缺陷病毒等）传播，对临床医生构成重大风险。蚀刻鱼鳞转化为生物载片后表现出优异的光学透明度和亲水性，使其能够借助3D打印的模拟载片支架直接用于显微镜检查，因为生物载片是1厘米×1厘米的片。
作为概念验证，在生物载片上安装的各种样品的比较成像研究显示出与常规玻璃载片相当的清晰度和分辨率，确认了它们适用于各种显微镜应用。将废弃鱼鳞生物废料转化为适用于多种物种（包括原核和真核细胞以及组织横截面）多重显微镜检查的高度透明生物载片的示意图示意图如图1所示。此外，生物载片促进了使用共聚焦显微镜对细胞和组织进行基于染色的监测，能够承受激光激发，强调了它们作为高分辨率显微镜以及微生物和临床诊断的环保多功能平台的潜力。
鳞片的胶原和矿物质丰富组成可能有助于其在加工后的透明度和刚性，从而模拟玻璃的性能。重要的是，生物载片的使用通过将水产养殖废料增值为功能性实验室材料，引入了可持续的替代方案。这不仅减少了对能源密集型玻璃生产的依赖，还通过生物降解性解决了废物管理挑战。虽然当前结果验证了它们与常规显微镜的兼容性。在均匀性和耐久性方面的进一步改进可以扩展它们在高通量和先进成像平台中的效用。除了安全性之外，这种方法也符合培养环境稳定和可持续实践的更广泛要求。
3.1 透明生物载片的衍生、形态和光学表征
用Milli-Q水彻底洗涤以去除表面单糖、沙子和其他碎屑后，随后对完整鱼鳞进行碱和酸蚀刻导致其脱细胞和脱矿质，获得内部透明的角膜基质层状骨架，命名为“生物载片”。蚀刻处理使鱼鳞从约0.425毫米±0.025毫米变薄到约0.11±0.02毫米，通过使用螺旋测微器测量50个样品（图S5），提高了它们的高透明度和均匀性。随着每个蚀刻步骤，透明度的演变逐渐增加，如放置在下面的标签“BIO-SLIDE”更清晰的外观所反映（图4c）。蚀刻不限于Labeo rohita，并且可以使用其他鱼种如Catla catla和Clupea ilisha的鳞片生产生物载片（图S9）。
为了验证生物载片用于显微镜实验，使用落射荧光显微镜检查了它们的表面结构。原始生物载片样品显示自然图案结构（图2a），可能源于鱼鳞的胶原层次结构，而玻璃载片（图2d）显示光滑无特征表面。尽管存在这些微小的结构差异，光学表征确认了生物载片和玻璃载片之间的可比性能。这些脊如此之小（约45-75纳米），并且不干扰或影响任何样品成像和/或进行的染色。UV-vis吸收光谱（图2e）显示生物载片在可见光区域（350-900纳米）具有可忽略的吸光度，与玻璃相似，确保成像过程中背景干扰最小。相应地，透射光谱（图2f）证明生物载片在可见波长范围内实现高透明度，透射值超过82%，几乎与常规玻璃载片重叠。这些结果共同验证了生物载片保留了显微镜所需的光学清晰度，有效传输光而无失真或显著散射。鱼鳞固有的生物分子组成，包括羟基磷灰石和胶原，可能有助于其在加工后的光学性能。重要的是，这项工作强调这种生物废料衍生的基底可以匹配标准玻璃载片的质量，同时提供可持续性、生物降解性和减少环境影响的额外优势。表面抛光和均匀性方面的未来改进可以进一步增强其一致性，将生物载片定位为常规实验室和教育显微镜的可靠环保替代品。
3.2 透明生物载片的样品滴铸能力
生物载片的样品滴铸潜力，使用接触角测量，显示生物载片是亲水性的，接触角为81°（图3a）。生物载片作为时间函数的润湿性显示接触角在2分钟内从83°降低到81°，之后角度保持恒定（图3a）。为了容纳非水悬浮样品成像，生物载片涂有40%硝化纤维素，这样做不反映它们的接触角（图3a）。生物载片显示出高机械强度，拉伸强度为约40±4 mPa（图3b），这是由于鱼鳞矿化层内层次取向的胶原纤维和羟基磷灰石（图3b）。这种高拉伸强度和可塑性确保在样品处理用于各种显微镜观察时抵抗机械剪切和撕裂的稳定性。总之，这些特性使我们的生物载片兼容稀有、溶剂兼容（图S7）、疏水性和亲水性样品标本的显微镜观察。
3.3 可重复使用的生物载片支架的设计和3D打印
由于我们的生物载片是1厘米×1厘米的片，为了确保与标准显微镜基础设施的兼容性，设计了一个定制的3D打印支架（图4）。该支架可重复使用，中间有一个保持槽以安装生物载片（图4a）。示意图显示了横截面和尺寸布局，使支架能够模拟常规玻璃载片的足迹。生物载片在支撑物上的保持位置正好标记在类似载片的支撑物中间，以便可以安全地安装到显微镜载物台上，并落在物镜中心。这种设计克服了鳞片尺寸和几何形状的可变性，确保可靠的集成，而无需仪器修改。
3.4 在生物载片上成像各种生物标本
生物载片用于显微镜成像的兼容性和适用性首先通过观察细菌进行验证。我们小心地选择了杆状革兰氏阴性（大肠杆菌）和球状革兰氏阳性（金黄色葡萄球菌）细菌（图5a-d），以推断可以可视化不同物种和形状的细菌。选择两个明显远缘物种的另一个原因是建立我们的生物载片对各种生物染色程序的无干扰，在这种情况下暴露于结晶紫和藏红，确认标准生物染色和成像工作流程不受影响（图5）。如我们预测，生物载片完美工作，捕获了与玻璃载片上类似成像相当的细菌图像（图5a-d）。
了解到我们的生物载片可用于显微镜检查后，为了验证其在成像中的多样化用途，我们进一步利用生物载片可视化其他高等生物。代表性显微照片表明，植物叶片截面（图6a）、植物茎截面（图6c）和花粉粒结构（图6e）可以清晰可视化，具有出色的对比度和分辨率，与典型玻璃载片上的类似成像相当（图6b、d和f）。可以推断，使用我们的生物载片可以清晰可视化不同植物部位的横截面。
同样，我们的生物载片显示出高兼容性，以可视化、检查和捕获不同的真核细胞系，包括MDA-MB-231（图7）和HeLa（图S8），并使用不同的染色染料，如SynaptoRed C2染色细胞质和DAPI可视化细胞核，以更广泛地利用我们的生物载片（图7和S8）。不同的染色方案产生清晰的细胞轮廓、明确的结构和最小的背景干扰，验证了生物载片支持体外细胞成像的能力。所有标本均以高清晰度和对比度可视化，与玻璃载片相当，确认了生物载片与各种显微镜应用的兼容性。
为了进一步验证生物载片用于荧光显微镜的潜力，我们对小鼠脊髓横截面进行了荧光免疫组织化学，并使用共聚焦激光扫描显微镜对其成像。生物载片在不同通道中的自发荧光测量 – UV（激发：377.5纳米；发射：457.5纳米）、FITC（激发：475纳米；发射：535纳米）和TRITC（激发：550纳米；发射：603.5） – 与玻璃载片相比略高，但在可接受范围内（图S11），并且不影响图像质量（图7和8）。尽管生物载片显示出比玻璃载片略高的自发荧光，这将在图像分析中处理，其中背景减法将导致校正的荧光强度。
免疫组织化学评估显示，脊髓切片良好地粘附到硝化纤维素涂层的生物载片上，并显示组织形态的保存（图S10）。NeuN阳性细胞（显示为红色）在脊髓组织切片上清晰可视化。这表明生物载片促进抗体渗透和抗原-抗体结合，类似于在显微镜玻璃载片上观察到的结合（图8）。此外，共聚焦显微镜成像确认生物载片能够高分辨率可视化脊髓组织切片中的荧光神经元。此外，为了证明生物载片在成像较厚组织切片方面的性能，我们对30微米脊髓切片进行了荧光成像（图S12）。这些结果突出了它们在组织学和细胞学应用方面与玻璃载片相当的多功能性（图S13）。
为了解释我们生物载片上的微小表面不规则性并提高其在高分辨率成像中的性能，我们目前正在进行表面工程实验。此外，我们计划熔化鳞片并使用光滑模具将其铸造成生物载片，利用鳞片固有的聚合能力。
总之，这些发现表明，鱼鳞衍生的生物载片是光学透明、机械坚固和生物相容的，支持显微镜检查。结合定制的3D打印适配器，它们可以无缝集成到现有的实验室工作流程中。除了其技术性能外，生物载片通过将水产养殖废料增值为可生物降解的实验室工具，提供生态和经济效益，减少对能源密集型玻璃生产的依赖，并符合循环经济原则。通过均匀性、耐久性和大规模标准化方面的进一步改进，生物载片有望在教育、诊断和生物医学研究中作为玻璃载片的可持续替代品。
4 结论
本研究实现了鱼鳞衍生的生物载片作为传统显微镜玻璃载片的可持续、可生物降解和低成本替代品。通过简单蚀刻和与定制3D打印载片支架的集成，生物载片表现出优异的光学清晰度、高透光率、亲水性和机械坚固性，使其与标准光/荧光显微镜和共聚焦平台高度兼容。植物和组织切片、微生物、染色细胞和体外培养细胞的比较成像确认生物载片提供与玻璃载片相当的分辨率和对比度。表面表征进一步揭示了可调节的润湿性，为各种生物应用提供了灵活性。重要的是，生物载片解决了传统玻璃载片的几个局限性。玻璃载片制造能源密集、易碎且不可生物降解，导致持久的实验室废物。其脆性使它们容易破碎，产生锋利的碎片，对实验室人员构成重大安全风险，特别是在教学和临床环境中。相比之下，生物载片不仅增值了水产养殖废物，而且提供生物降解性、表面可调性、降低的破裂风险和整体更安全的处理，将其定位为可持续、安全且用户友好的替代品。生物载片能够无缝集成到现有实验室工作流程中的能力强调了它们在低资源诊断、教育实验室和可持续研究实践中的转化潜力。通过未来在抛光、实现表面均匀性和可扩展制造方面的改进，生物载片有望成为玻璃载片的可行绿色替代品，在减少实验室危险的同时，弥合生态责任与科学效用。
