靶向癌细胞线粒体的多重单线态氧递送系统：一种增强抗癌效力的新策略

《Smart Molecules》：Targeting cancer cell mitochondria with a multivalent source of singlet oxygen

本文设计并合成了一种靶向线粒体的三重吡啶酮内过氧化物前药(ETPy-TPP)。研究表明，该化合物能在肿瘤细胞内特异性释放大量单线态氧(1O2)，有效诱导癌细胞凋亡，显著抑制其增殖、迁移与侵袭，并对正常细胞表现出良好的生物相容性。这项研究为克服传统光动力疗法(PDT)的穿透深度限制，实现化学动力学疗法(CDT)与线粒体靶向治疗的结合提供了新思路。

1 引言

传统的癌症光动力疗法(PDT)依赖外部光源激活光敏剂产生活性氧(特别是单线态氧¹O₂)来杀伤肿瘤细胞。然而，光在生物组织中的穿透深度有限，严重制约了PDT对深层或内部肿瘤的治疗应用。为解决这一瓶颈，化学驱动的单线态氧疗法应运而生，其核心是开发能在肿瘤微环境中自发释放¹O₂的化学前药。本文研究聚焦于一类被称为“内过氧化物”的化合物，它们可在生理温度下通过热环化逆反应，定量释放¹O₂。其中，2-吡啶酮衍生物的內过氧化物因其良好的稳定性和可控的释放动力学而备受关注。

本工作的研究目标是进一步提升这类疗法的效力。其核心思路是设计一种“多重”单线态氧递送系统，即在一个分子上集成多个內过氧化物模块，以期在靶点处释放更多¹O₂。同时，考虑到线粒体作为细胞的“能量工厂”和凋亡调控中心，是诱导癌细胞凋亡的极佳靶点，研究将线粒体靶向基团——三苯基膦(TPP)引入分子设计中。最终，团队合成了一种名为ETPy-TPP的化合物，它包含三个吡啶酮内过氧化物模块和一个TPP靶向基团，旨在实现向癌细胞线粒体的高效、多重单线态氧递送。

2 结果与讨论

2.1 单线态氧递送剂的设计

研究设计并合成了目标化合物ETPy-TPP及其对照化合物TPy-TPP。两者都含有线粒体靶向的TPP基团，但ETPy-TPP是三个吡啶酮内过氧化物模块的“三重”版本，而TPy-TPP是相应的、不释放¹O₂的吡啶酮前体。分子通过乙炔连接臂和常见的缓冲剂TRIS(三羟甲基氨基甲烷)作为分支连接体构建。详细的合成路径在Scheme 1中展示，最终成功获得了目标产物。

2.2 环化逆反应

通过¹H NMR在37°C下监测ETPy-TPP向TPy-TPP的转化，计算出其半衰期约为4.5小时。三个內过氧化物模块由于空间距离较远，彼此间无明显的空间或电子相互作用，表现出基本相同的反应速率。使用特异性探针1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)的实验证实了ETPy-TPP能够有效释放单线态氧。

2.3 MTT与活死细胞染色实验；单线态氧荧光成像

细胞毒性评估是核心环节。MTT实验显示，ETPy-TPP对多种癌细胞系(A549, MCF-7, HepG2, HeLa, 4T1)均表现出显著的杀伤效果，其IC₅₀值均在20 μM左右(例如A549为18.3 μM)，这比先前报道的单功能內过氧化物的效力高出近两个数量级。至关重要的是，对照化合物TPy-TPP在所测试浓度下无任何细胞毒性，而ETPy-TPP对多种正常细胞也显示出良好的生物相容性。

为了直观证实单线态氧在细胞内的生成，研究使用了活性氧(ROS)探针DCFH-DA和线粒体特异性单线态氧探针Si-DMA进行荧光成像。结果明确显示，只有ETPy-TPP处理的A549细胞内产生了强烈的荧光信号，表明其在线粒体内成功释放了¹O₂。使用JC-1染料检测线粒体膜电位的变化进一步证实，ETPy-TPP处理导致线粒体膜电位下降，这是细胞凋亡启动的关键早期事件。

活死细胞双染实验(Calcein-AM/PI)直观地验证了上述结果：ETPy-TPP处理导致大量A549细胞死亡(红色)，而TPy-TPP处理组与对照组无显著差异。此外，在更接近体内肿瘤微环境的3D肿瘤球体模型中，ETPy-TPP同样展现出强大的抗肿瘤作用。

2.4 克隆形成实验、流式细胞术、侵袭实验

克隆形成实验被认为是评估药物长期疗效的更稳健指标。实验表明，15 μM的ETPy-TPP就能将A549细胞的克隆形成数量减少至对照组的一半以下。

流式细胞术(Annexin V-FITC/PI染色)分析为ETPy-TPP诱导细胞凋亡提供了定量证据。结果显示，经ETPy-TPP处理的细胞，其凋亡细胞比例(Q2区)显著高于对照组和TPy-TPP处理组。

划痕愈合实验和Transwell迁移实验用于评估癌细胞迁移和侵袭能力。结果表明，ETPy-TPP能显著抑制A549细胞的迁移和侵袭。在Transwell实验中，穿过小室膜的细胞数量在处理组大幅减少，定量分析证实了其迁移能力的显著下降。

3 结论

本项研究的结果清晰地表明，利用多重吡啶酮内过氧化物靶向癌细胞线粒体释放单线态氧的策略，在抗癌活性方面展现出巨大优势。无论是在二维还是三维细胞培养模型中，MTT和克隆形成实验都一致证实了其高效性。荧光成像结果强有力地支持了内过氧化物能高效递送单线态氧至线粒体的机制。与先前报道的单功能类似物相比，这种三重设计显著提高了效力。研究团队确信，这种多价态的单线态氧源将在未来的癌症治疗策略中找到实际应用，相关的研究工作正在进行中。