《Food Science & Nutrition》：Chemical Fingerprinting of Spiranthes spiralis L. Methanol Seed Extract: Spectroscopic, Chromatographic, and Computational Approaches
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本文运用光谱、色谱及计算化学方法，对Spiranthes spiralis种子甲醇提取物进行了系统表征。研究发现，其富含酚类、黄酮等活性成分，展现出优异的DPPH自由基清除能力（IC50= 0.21 mg/mL）。通过GC-MS鉴定出包括2,2-二甲氧基丁烷、肼基硫代甲酰胺在内的20种生物活性化合物。进一步的分子对接、密度泛函理论（DFT）、非共价相互作用（NCI）及分子静电势（MEP）等计算分析，揭示了主要化合物的反应性、稳定性和与GPR52靶点的高结合亲和力，为未来药理与生物技术应用提供了新视角。
形态学与傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
本研究首先对Spiranthes spiralis种子进行了形态学表征。扫描电子显微镜（SEM）观察显示，种子呈独特的纺锤形，基部细胞具有明显的加厚、倾斜的脊状结构，种皮细胞为多边形、等径或拉长形。所有种子沿其纵向外壁均有一条明显的凹陷线，表明此结构特征具有一致性。
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，揭示了种子提取物中存在的关键官能团。光谱在3331 cm-1处出现宽峰，对应O-H伸缩振动；2918和2855 cm-1处的吸收带与–CH2–伸缩振动相关；1742 cm-1处的峰指示C=O伸缩振动，与半纤维素中的羧基和乙酰基有关；1633 cm-1处的波段则归因于蛋白质中酰胺基团的C=O伸缩振动。其他特征峰分别对应纤维素、木质素、酚酸等成分，表明提取物中含有丰富的酚类化合物、蛋白质和多糖。
抗氧化活性与酚类成分谱
对S. spiralis种子甲醇提取物的抗氧化活性及次生代谢物含量进行了定量评估。总酚含量测定为24.65 ± 1.43 mg 没食子酸当量（GAE）/g干重。总黄酮含量为43.98 ± 3.10 mg 槲皮素当量（QE）/g干重。黄烷醇含量为37.09 ± 1.11 mg QE/g干重。单宁含量较低，为2.13 ± 0.13 mg GAE/g干重。而原花青素含量则相对较高，达到138.78 ± 20.46 mg 儿茶素当量（CAE）/g干重。
尤为重要的是，通过DPPH自由基清除实验评估的抗氧化活性显示出很强的潜力，其IC50值为0.21 mg/mL。这一较强的抗氧化能力与较高的总酚含量呈现正相关关系，提示酚类化合物是提取物抗氧化作用的主要贡献者。
气相色谱-质谱（GC-MS）代谢物谱分析
利用GC-MS技术对甲醇提取物进行了生物活性植物化学成分鉴定，共检测出20种化合物。其中含量最丰富的五种化合物及其相对峰面积百分比分别为：2,2-二甲氧基丁烷（18.02%）、肼基硫代甲酰胺（9.97%）、二仲丁基醚（6.64%）、羟基乙酸酰肼（6.39%）和4,4,6,6-四甲基-1,3-二氧六环（5.06%）。这些化合物被认为对植物的抗氧化和生物活性有显著贡献。研究也指出，其中一些化合物如直链烷烃（癸烷、十一烷）和支链醚2,2-二甲氧基丁烷可能具有毒性，但同时2,2-二甲氧基丁烷也显示出多种治疗潜力。肼基硫代甲酰胺则因其结构中氮和硫供体的多种配位模式，被认为是具有抗肿瘤、抗原虫和抗病毒活性的多功能生物促进剂。
分子对接与ADMET预测
针对GC-MS鉴定出的五种主要化合物，进行了与GPR52受体（PDB ID: 6LI1）的分子对接研究。结果显示，4,4,6,6-四甲基-1,3-二氧六环的结合亲和力最高，对接分数为-6.3 kcal/mol，主要通过烷基和Pi-烷基相互作用与LEU324、VAL4、ILE5、LYS308等残基结合。羟基乙酸酰肼的结合能为-4.3 kcal/mol，与TYR263、HIS72、HIS73形成多个氢键。二仲丁基醚的结合亲和力为-3.9 kcal/mol，涉及Pi-Pi堆积和广泛的烷基相互作用。肼基硫代甲酰胺和2,2-二甲氧基丁烷的结合分数均为-3.6 kcal/mol，前者形成氢键和Pi-硫相互作用，后者则通过Pi-烷基接触相互作用。
吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）预测显示，羟基乙酸酰肼和肼基硫代甲酰胺在AMES试验中呈阳性，提示潜在的致突变性。所有化合物均未预测会抑制hERG通道（无心脏毒性风险），也无肝毒性。然而，4,4,6,6-四甲基-1,3-二氧六环、二仲丁基醚和2,2-二甲氧基丁烷显示出皮肤致敏的潜在可能。在急性口服毒性方面，肼基硫代甲酰胺的LD50值最高，表明急性毒性较低，但其慢性口服毒性的最低观察有害作用水平（LOAEL）值最低，提示需关注长期暴露风险。
密度泛函理论（DFT）计算与全局反应性参数
采用B3LYP/6-31G(d,p)基组对五种主要化合物在气相和甲醇相中进行了几何结构优化和频率计算，确认所得结构为能量最小值。
通过前沿分子轨道（FMO）分析，计算了最高占据分子轨道（HOMO）和最低未占分子轨道（LUMO）能级及其差值（ΔE）。在甲醇相中，ΔE值排序为：2,2-二甲氧基丁烷 > 二仲丁基醚 > 4,4,6,6-四甲基-1,3-二氧六环 > 羟基乙酸酰肼 > 肼基硫代甲酰胺。其中，2,2-二甲氧基丁烷的ΔE值最大（9.390 eV），表明其电子结构最稳定、化学反应性最低。相反，肼基硫代甲酰胺的ΔE值最小（3.423 eV），暗示其具有较高的化学反应性和潜在的生物活性。
全局反应性描述符的计算结果支持了这一趋势。肼基硫代甲酰胺显示出最低的化学硬度（η = 1.711 eV）和最高的化学软度（ζ = 0.292 1/eV），表明其化学柔韧性和与生物靶点相互作用的潜力较高。同时，它具有最高的亲电性指数（ω = 4.453 eV）和最负的化学势（μ = -3.904 eV），表现出强烈的亲电特性。而其他化合物则具有较高的化学硬度、较低的亲电性和较不活泼的电子结构。
非共价相互作用（NCI）与分子静电势（MEP）分析
通过降低密度梯度（RDG）分析可视化分子的弱相互作用区域。在所有化合物中均检测到绿色的范德华相互作用区域。在具有环状结构的4,4,6,6-四甲基-1,3-二氧六环中，观察到暗红色区域表示的立体排斥作用。在羟基乙酸酰肼和肼基硫代甲酰胺的NCI-RDG图中，出现了代表强分子间相互作用（特别是氢键）的细长蓝色条带。
MEP分析用于识别分子表面的亲电和亲核区域。在二仲丁基醚、2,2-二甲氧基丁烷和4,4,6,6-四甲基-1,3-二氧六环中，分子结构中氧原子周围显示为红色的富电子区（亲核攻击位点），其余骨架多为绿色的中性或弱相互作用区。在羟基乙酸酰肼的MEP中，C=O和O-H基团周围呈现深红色富电子区，而N-H和–NH2基团及O-H上的氢原子则显示为蓝色的缺电子区，可作为潜在的氢键供体中心。这些信息对于理解分子识别和生物活性至关重要。
总结
综合来看，该研究通过实验与计算相结合的多学科方法，全面表征了Spiranthes spiralis种子甲醇提取物的化学组成与生物活性潜力。种子富含酚类和黄酮类化合物，表现出显著的抗氧化活性。GC-MS鉴定出的多种生物活性成分，尤其是肼基硫代甲酰胺，经DFT计算显示具有高反应性和亲电性。分子对接揭示了这些成分与GPR52受体具有良好的结合潜力。尽管ADMET预测提示部分成分存在毒性风险，但整体研究结果凸显了S. spiralis种子在开发新型功能性食品、天然抗氧化剂以及未来药物先导化合物方面的巨大价值，为兰科植物资源的深入开发和利用提供了重要的科学依据。
