《Nature Communications》：Active pixel power control for crosstalk-free All-optical neural interrogation
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在双光子钙成像过程中，光门控通道（如ChR2）的意外激活会引入伪影，污染神经活动记录。为解决此难题，研究人员开展了一项关于“主动像素功率控制”技术的研究。该研究实现了单台飞秒激光器同时进行双光子光遗传学操控和钙成像，显著抑制了串扰伪影，成功应用于斑马鱼幼体活体脑。其结果为高保真神经环路动态与因果关系的解析提供了稳健框架，可无缝集成于全球实验室广泛使用的双光子显微镜系统。
在探索大脑奥秘的征途上，神经科学家们一直梦想能像操作一台精密的仪器一样，同时精确地“拨动”和“读取”大脑神经元的信号。全光学神经调控（All-optical neural interrogation）技术，结合了高分辨率双光子刺激与成像，让这一梦想照进现实。它允许研究人员在斑马鱼、小鼠等多种模式生物中，同时对神经元活动进行精准操纵和监测，为解析复杂神经环路的动态与因果关系提供了前所未有的利器。然而，这项前沿技术也面临着一个棘手的“内讧”问题：当科学家们使用双光子显微镜，通过基因编码的钙指示剂（Genetically Encoded Calcium Indicators, GECIs）来观察神经元活动（即钙成像）时，用于激发钙信号的激光，往往会“不小心”也激活那些用来操控神经元的光敏感离子通道，比如大名鼎鼎的通道视紫红质（Channelrhodopsin, ChR）。这种“意外激活”就像是你在专心听一个人说话时，旁边却总有人用同样的语言对你喊叫，导致你无法分辨真正想听的内容。它会在神经信号记录中引入人为的扰动和伪影，严重污染测量数据，使得“读取”的结果不再纯粹，极大地干扰了对神经环路功能的精确解读。
为了解决这一信号串扰（cross-talk）的瓶颈，一项发表在《自然·通讯》（Nature Communications）上的研究提出了一个巧妙的解决方案——主动像素功率控制（Active Pixel Power Control, APPC）方法。该研究团队的核心目标是，仅使用单一飞秒激光器，就能实现同步的双光子光遗传学操纵和钙成像，并最大限度减少操纵与成像之间的相互干扰。他们的思路颇具巧思：不是采用固定的激光功率进行扫描，而是动态地调整成像激光在每个扫描像素点的功率。简单来说，就是在需要进行光遗传学刺激的特定神经元位置，系统自动调高激光功率以有效激活ChR；而在其他仅需成像的区域，则迅速将激光功率降低到足以激发GECI产生钙信号、但又不足以意外激活ChR的水平。这种“指哪打哪”、“按需供能”的策略，旨在从源头上遏制串扰伪影的产生。
为了验证这项技术的强大能力，研究人员将其应用于活体斑马鱼幼体的大脑。斑马鱼大脑透明，是进行在体光学研究的经典模型。研究结果表明，APPC方法在有效抑制光遗传学伪影的同时，很好地保留了GECI钙信号的采集质量。这意味着，研究人员终于能够更清晰、更真实地“聆听”神经元的电活动“对话”，而不被操控手段本身的“噪音”所淹没。这项技术显著提升了神经环路解析的准确性，将全光学神经调控的精度推向了一个新高度。更重要的是，APPC方案可以与全世界各实验室广泛使用的商业双光子显微镜系统无缝集成，无需复杂昂贵的改装，极大地提升了其普适性和推广潜力，为在各种模式生物中进行高保真的神经环路动态与因果关系研究提供了一个强大而通用的技术框架。
本研究主要依赖于几项关键的技术方法：一是主动像素功率控制（APPC）技术本身，它通过软件控制实时调制扫描激光器的声光调制器，实现像素级的激光功率动态调整。二是双光子显微成像与刺激系统，使用单一飞秒激光器作为光源，分别用于激发基因编码钙指示剂（GECI）和光敏通道通道视紫红质（ChR）。三是活体成像实验模型，研究在活体斑马鱼（larval zebrafish）幼体大脑中进行，利用其透明的特性进行深层脑区观测。四是相关的光遗传学工具与钙指示剂，涉及特定的ChR变体与GECI（如GCaMP）的联合表达。
APPC有效保持了钙成像的信号质量
研究人员通过比较使用APPC与不使用APPC（即传统固定功率成像）条件下的GCaMP钙信号，评估了该方法对成像效果的影响。结论是，在施加光遗传学刺激期间，APPC能够维持与基线状态相似的GCaMP响应幅值和信噪比，证明其动态降功率策略并未牺牲钙信号采集的保真度。
APPC显著抑制了光遗传学刺激引入的串扰伪影
通过分析在仅表达GECI（不表达ChR）的对照样本中，施加光遗传学刺激参数激光时记录到的信号，可以直接量化串扰伪影。研究结果显示，采用APPC方法后，此类由激光直接激发GECI或产生背景荧光所引起的伪影信号被大幅度抑制，显著低于传统固定功率成像模式下的伪影水平。
在活体斑马鱼脑中实现同步操控与无串扰成像
将APPC技术应用于表达ChR和GECI的活体斑马鱼幼体大脑，研究人员成功演示了在单次实验中对特定神经元群体进行双光子光遗传学刺激的同时，对其活动及周边神经回路进行高保真钙成像。结果表明，刺激位点的神经元活动能被有效激活，而在成像区域记录到的神经网络活动动态清晰，受串扰污染极小，验证了APPC在复杂活体环境中实现同步、精准全光学神经调控的可行性。
与现有显微镜系统的兼容性
研究还强调并演示了APPC技术方案的实用性。它主要通过软件升级控制声光调制器来实现，无需改变现有显微镜的光路硬件核心，因此可以无缝集成到全球众多实验室已广泛使用的标准双光子显微镜系统中，降低了技术门槛和推广成本。
本研究发展并验证了名为主动像素功率控制（APPC）的新方法，它通过动态调控成像激光在每个扫描像素点的功率，成功解决了双光子钙成像与光遗传学刺激之间的信号串扰难题。该技术使得利用单一飞秒激光源同时进行高精度光遗传学操纵和高保真钙成像成为可能，在活体斑马鱼脑模型中实现了对神经环路的“读写”同步且互不干扰。其核心结论是，APPC能够在几乎不损失基因编码钙指示剂（GECI）成像质量的前提下，显著抑制由光刺激引起的人工伪影，从而极大提升了全光学神经调控的准确性和可靠性。这项工作的意义在于，它提供了一种强健、实用且易于推广的技术框架，有望广泛应用于各种模式生物，推动神经科学家在体、高精度地解析神经环路的动态编码与因果机制，是神经科学研究工具的一项重要进步。
