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本研究利用甲醇和丙酮处理微丝藻材料，评估其干燥保存环境敏感型细菌的潜力。通过XRD、XPS和FTIR分析发现，处理材料表面官能团和元素组成变化，但均能有效保存细菌（存活率>75%，丙酮处理组83.2%）。显微观察显示细菌嵌入多糖基质中。结果表明，微丝藻多糖材料可作为低成本、无需设备的微生物干燥保存替代方案。
袁小龙|郑涛|李正科|夏婉霞|高翔
四川科技大学生物工程学院，宜宾，643002，中国
摘要
开发新的微生物保存技术可以改进现有的方法。像Nostoc flagelliforme这样的宏观蓝藻富含胞外多糖，可能在这一应用中具有潜力。本研究调查了未经处理的、经甲醇处理的和经丙酮处理的N. flagelliforme材料在细菌干保存方面的效果。甲醇或丙酮处理会破坏细胞结构，同时保留多糖成分，主要是细胞壁多糖和胞外多糖。通过X射线衍射、X射线光电子能谱和傅里叶变换红外光谱对这三种材料的物理化学性质进行了表征。所有三种材料都表现出晶体结构并具有特定的官能团；甲醇和丙酮处理改变了它们的表面元素组成和官能团。在室温下干燥储存360天后，所有材料都能有效保存细菌细胞，存活率超过75%。其中，经丙酮处理的N. flagelliforme材料表现最佳（存活率为83.2%）。通过荧光染色细胞的显微镜观察进一步验证了细菌的活力。扫描电子显微镜观察显示，细菌细胞附着或嵌入在表面多糖基质中。本研究强调了天然富含胞外多糖的生物材料作为一种低成本、无需设备的微生物干保存方法的潜力。
引言
微生物保存是一种在长期储存过程中保持微生物细胞结构完整性和生物转化能力的关键技术。迄今为止，已经开发了多种保存策略以满足不同应用领域的要求。冷藏通常用于短期储存（通常少于3个月）[1]，[2]。琼脂斜面培养和石蜡法为某些细菌提供了简单经济的方法，可在室温下保持数年的活力[2]，[3]。对于中长期的保存，冷冻干燥因其能够保持高细胞活力、确保长期稳定性并消除定期转移培养的需要而经常被使用[4]，但其高昂的成本限制了大规模工业应用[5]。目前，冷冻保存是长期储存的首选方法，因为它能提供高细胞存活率，并在低温或超低温下最小化遗传或表型改变的风险[4]，[6]。然而，冷冻保存的一个关键挑战是冰晶的形成、生长和再结晶可能会对细胞造成机械损伤[7]，[8]。为了解决这个问题，已经使用了冰抑制材料，如冷冻保护剂、抗冻蛋白、合成聚合物和氢凝胶作为保护剂[8]。这些材料可以抑制冰的再结晶，降低冰点，并控制冰的形态，从而显著改善冷冻保存的效果[8]，[9]。此外，还探索了细胞固定化、电纺[10]、电喷雾[11]和亚致死应力[4]等新型策略作为传统方法的补充。因此，开发高效的保存策略对于降低成本、简化操作程序以及在细胞稳定性和损伤最小化之间达到最佳平衡至关重要。
蓝藻是一类光合微生物，具有多样的形态和细胞结构以及广泛的生态分布[12]。它们的细胞能够分泌胞外聚合物（EPS），主要由多糖组成[13]。这种EPS层可以在极端环境压力下显著提高细胞存活率，包括辐射、干燥和高温[14]，[15]。具体来说，EPS提供了一个灵活的结构支架，可以适应波动条件下的快速生物物理和生理变化[16]。EPS通过抑制膜囊泡融合来帮助在干燥和冷冻干燥过程中保持膜完整性[17]。EPS还可以作为固定化基质，积累超氧化物歧化酶等分泌蛋白以减轻干燥压力[18]，[19]。除了这些保护作用外，与合成聚合物和氢凝胶相比，EPS还具有优异的生物降解性和生物相容性[8]，[20]。鉴于EPS的这种多功能性，基于多糖的材料成为微生物保存的潜在替代品。先前的一项研究报道了使用黄原胶（来自Xanthomonas campestris的多糖）溶液进行非冷藏保存细菌病原体的方法[21]。然而，蓝藻多糖或EPS在细菌保存中的应用仍大部分未被探索。
Nostoc flagelliforme是一种具有毛发状形态的陆地宏观蓝藻，对长期脱水压力具有显著的耐受性[22]，[23]。N. flagelliforme的野外样本含有约56%的碳水化合物[24]，其热水可溶的胞外多糖占干细胞质量的10-20%[25]。重新水化后，EPS基质会膨胀，在显微镜下显示出网状结构[26]。N. flagelliforme胞外多糖的分子量为1.02 × 103 kDa[27]。其单糖组成也已得到表征，葡萄糖醛酸含量为4-5%[27]，[28]。这种含有尿酸的多糖据报道具有强抗氧化活性，以及多种生物活性，包括抗病毒、抗肿瘤和降脂活性[29]，[30]。N. flagelliforme的EPS基质包含胞外蛋白（主要是WspA）、类菌孢氨酸氨基酸（MAAs）和scytonemin，但这些成分仅占干质量的很小一部分[31]，[32]。甲醇和丙酮通常分别用于从N. flagelliforme中提取MAAs和scytonemin。用甲醇或丙酮处理后用水冲洗也可以导致细胞破裂，并形成由细胞壁和胞外多糖组成的残留物。因此，N. flagelliforme样本可以作为富含胞外多糖的材料，用于生物技术应用。
N. flagelliforme样本表面粗糙，具有不规则的起伏、突起和裂纹[22]，[33]。许多细菌居住在野外采集的N. flagelliforme表面[34]。这种基于胞外多糖的粗糙表面可能也保护了相关的细菌免受环境压力的影响。基于上述蓝藻胞外多糖的优势，我们旨在评估经灭菌的N. flagelliforme材料在细菌保存中的应用潜力，特别是在干燥环境中。在本研究中，首先对灭菌的N. flagelliforme及其甲醇处理和丙酮处理的衍生物的物理化学性质进行了表征。然后，使用对环境压力敏感的细菌Bacillus sp. WL1菌株在不同温度下评估了它们的细菌保存能力。这项研究将通过利用蓝藻生物材料作为一种低成本、无需设备的方法来扩展微生物保存技术，为食品或农业菌株的保存提供另一种方法。
部分摘录
蓝藻材料和细菌菌株
N. flagelliforme的自然种群广泛分布于中国西部和西北部的干旱和半干旱草原[22]。本研究中使用了从中国银川市采集的N. flagelliforme样本。通过用水重新水化并反复清洗去除表面土壤后，样品在室温（25°C）下自然风干。干燥后的样品（20 mg）进一步用无菌水重新水化，浸入70%乙醇中30秒，然后...
蓝藻材料的XRD和FTIR分析
通过XRD分析表征了三种蓝藻材料的结晶性（图2A）。所有材料的衍射图谱显示出相同的2θ峰位置和线形。在9°和21°观察到的特征峰表明存在晶体结构。
三种蓝藻材料的FTIR光谱显示了主要属于多糖的官能团（图2B）。显著的峰包括：3600–3200 cm
?1，对应于O
H
讨论
N. flagelliforme表现为毛发状的丝状体，由许多平行排列的细胞组成，并包裹在厚厚的胞外多糖基质中[22]。N. flagelliforme丝状体的表面粗糙，具有不规则的起伏、突起和裂纹[33]。这种独特的微观结构有助于多种功能，包括气体交换、温度调节、水分吸收和土壤附着[22]。这种不规则的微观结构可能有助于...
结论
本研究考察了三种N. flagelliforme衍生物的材料，揭示了它们的物理化学性质及其在细菌干保存中的潜力。与未经处理的材料相比，经丙酮和甲醇处理的N. flagelliforme材料的物理化学性质在官能团和元素组成方面发生了不同程度的变化。然而，所有材料都能在室温下有效保存对环境压力敏感的细菌细胞
CRediT作者贡献声明
袁小龙：撰写——原始草稿、方法学、研究、正式分析。郑涛：可视化、方法学、研究。李正科：撰写——审稿与编辑。夏婉霞：撰写——审稿与编辑。高翔：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究部分得到了国家自然科学基金（编号：32171494）和四川省科技计划（编号：2025NSFSC2022）的支持。
