通过12-plex DiLeu同位素标记和双功能钛(IV)-IMAC材料实现糖肽和磷酸肽的高通量同时定量

本研究开发了一种高效的一体化工作流程，结合环氧-Ti??-IMAC材料与12-plex DiLeu同位素标记，实现N-糖基化和磷酸化的高通量同步富集与定量分析。通过分析APP/PS1转基因小鼠与野生型对照组的大脑样本，鉴定了1975个N-糖基化肽和1181个磷酸化肽，揭示了与阿尔茨海默病相关的磷酸化/糖基化修饰通路变化及分子机制。

　　

吴飞轩|王丹青|迪伦·尼古拉斯·塔邦|刘鹏凯|王子聪|刘远|安杰莉克·斯滕哈根|路易吉·普利亚内利|李凌军

威斯康星大学麦迪逊分校药学院，美国威斯康星州麦迪逊市53705

摘要

背景

蛋白质糖基化和磷酸化是关键的翻译后修饰（PTMs），它们调节着多种生理和病理过程。然而，由于这些修饰的丰度低且离子化效率差，对其进行全面表征仍然具有挑战性。最近使用环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC材料的技术进展使得能够同时富集N-糖肽、磷酸肽和甘露糖-6-磷酸糖肽。然而，对这些PTMs的高通量、多重定量分析仍然缺乏。本研究旨在开发一种高效策略，以实现跨多个生物样本的糖基化和磷酸化的同时富集、鉴定和定量比较。

结果

我们开发了一种高通量工作流程，将环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC富集与定制的N,N-二甲基亮氨酸（DiLeu）同位素标签结合，首次实现了N-糖基化和磷酸化的12重定量分析。这种简化的一管式样品制备方案能够从复杂的小鼠脑样本中稳健地同时富集和定量PTMs。将这种方法应用于APP/PS1转基因小鼠与野生型对照样本，共鉴定出1,975种N-糖肽和1,181种磷酸肽。比较分析揭示了与阿尔茨海默病（AD）相关病理变化相关的PTMs显著改变。这些差异修饰的蛋白质映射到关键生物途径上，包括突触组织、突触膜调节和细胞粘附。丰度模式显示了PTMs介导的信号传导的广泛紊乱，并为APP/PS1模型中的突触功能障碍提供了分子层面的见解。

意义与创新

这种集成的DiLeu同位素标记-环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC平台为糖基化和磷酸化的同时定量提供了强大的高通量解决方案，有助于详细研究PTMs之间的相互作用。通过揭示AD小鼠模型中的疾病相关修饰，该方法为识别机制性生物标志物和治疗靶点提供了新的机会。其多功能性和可扩展性使其广泛适用于各种生物系统中的PTMs研究，包括生物流体、细胞裂解物和组织。

引言

翻译后修饰（PTMs）是蛋白质在核糖体翻译后或蛋白质折叠和定位完成后发生的关键生化过程[1]。这些修饰通常由特定酶催化，涉及将各种化学基团、糖类甚至整个蛋白质共价添加到目标蛋白质的特定氨基酸残基上。在已知的许多PTMs中，糖基化和磷酸化是研究最广泛的两种，因为它们在多种生物过程中起着关键作用。磷酸化是一种动态且可逆的PTM，涉及将磷酸基团共价连接到蛋白质中的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的羟基上[2]。据估计，哺乳动物细胞中大约有三分之一的蛋白质在任何时候都处于磷酸化状态[3]。这一过程由激酶催化，激酶将磷酸基团从三磷酸腺苷（ATP）转移到目标残基上，而磷酸酶则去除磷酸基团，以确保蛋白质功能和信号通路的严格调控[4]。另一方面，糖基化涉及将碳水化合物部分（糖链）酶促连接到蛋白质的特定氨基酸残基上[5]。几乎所有蛋白质都经历某种形式的糖基化，这对生理和病理细胞功能都是必不可少的[6]、[7]。糖基化和磷酸化的失调与多种疾病的发展和进展有关，包括阿尔茨海默病（AD）和各种癌症[7]、[8]、[9]、[10]。因此，对这些PTMs的位点特异性研究对于理解它们的生物学作用至关重要。此外，同时分析多种PTMs不仅加深了对单个修饰的理解，还能够探索不同PTMs之间的相互作用[11]。

尽管如此，由于磷酸肽和糖肽的丰度低且离子化效率差，直接进行质谱（MS）分析仍然具有挑战性[12]。为了解决这些问题，在MS分析之前需要使用稳健的富集方法。磷酸肽通常使用金属氧化物亲和色谱（MOAC）或固定化金属亲和色谱（IMAC）进行富集[13]、[14]。对于糖肽，常见的富集方法包括肼化学、凝集素亲和色谱、硼酸富集和亲水相互作用色谱（HILIC）[15]、[16]。然而，这些策略的一个主要局限性是它们通常只关注单一PTM，尽管PTMs经常在蛋白质上同时发生，并且可以通过复杂的相互作用相互影响[17]。这种相互作用包括对邻近修饰位点的竞争性或非竞争性占据、激酶的糖基化以及糖基化相关酶的磷酸化[18]。为了研究这些相互作用，必须在同一蛋白质上以位点特异性背景下来检测PTMs。因此，一些研究采用了顺序富集方法[19]、[20]、[21]。此前，我们的实验室探索了市面上可购买的离心辅助提取Ti⁴⁺-IMAC（CAE-Ti-IMAC）材料的亲水特性，以探索其通过双重模式富集磷酸肽、糖肽和M6P糖肽的潜力[22]、[23]。这种方法利用了材料表面的羟基类似HILIC的机制，而磷酸肽则通过静电相互作用洗脱。然而，亲水性不足限制了该材料的糖肽富集效率。为了克服这一挑战，我们团队最近开发了一种亲水性增强的双功能Ti-IMAC材料，该材料嫁接了ATP（环氧-ATP-Ti⁴⁺），并且更易于制备。这种新材料在通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时富集糖基化和磷酸化肽方面表现出色[24]。

然而，一个主要瓶颈仍然是定量分析。双功能富集策略通常每个样本会产生六个以上的组分，当需要分析多个样本时，这会显著增加每次运行的变异性以及样品制备和仪器使用时间[25]。为了在单次MS/MS运行中实现高通量分析，稳定的同位素标记技术，特别是像市面上可购买的双串联质量标签（TMTs）和我们定制的DiLeu同位素标签这样的方法，在不同生物状态的比较蛋白质组学和PTMs研究中变得越来越流行[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。这些方法已被证明能够生成准确的定量结果，并具有高多重检测能力，减少了每次运行的变异并提高了分析通量[33]、[34]、[35]、[36]。与商业标签相比，DiLeu试剂的成本效益更高，并且可以在实验室内部高产量合成[27]。当与环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC富集结合使用时，DiLeu标记能够实现比无标记单次分析更高的高通量PTM定量，这对于研究PTMs之间的相互作用至关重要。

在这项研究中，我们开发了一种结合12重DiLeu同位素标记和环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC富集的工作流程，用于全面的N-糖蛋白组学和磷酸蛋白组学定量分析（图1）。为了从珍贵或有限的生物样本中提高肽的回收率，我们采用了一管式概念策略，使用可酸降解的洗涤剂，从而无需单独的脱盐步骤。该方法首先使用PANC-1细胞裂解物进行了验证，然后应用于APP/PS1 AD模型小鼠大脑中N-糖基化和磷酸化的表征。这种方法在糖肽和磷酸肽的同时定量方面非常有效，且组分间干扰最小，具有在未来进行磷酸化和N-糖基化及其相互作用的位点特异性定量分析的巨大潜力。

部分片段

化学品

二硫苏糖醇（DTT）和序列级胰蛋白酶来自Promega（威斯康星州麦迪逊）。Optima LC/MS级溶剂、甲酸（FA）、尿素、氯化钠、磷酸、氢氧化钠、碳酸钠和2,5-二羟基苯甲酸（DHB）来自Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）。三氟乙酸（TFA）、碘乙酰胺（IAA）、三乙胺碳酸盐（TEAB）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉四氟硼酸盐（DMTMM）来自...

使用12重DiLeu同位素标签和环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC材料同时定量N-糖肽和磷酸肽

在初步实验中，使用PANC-1细胞验证了通过结合DiLeu同位素标记和环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC富集来同时定量N-糖肽和磷酸肽的策略。鉴于PTMs的天然低丰度，采用了无需脱盐的一管式DiLeu标记工作流程，以最小化样品损失和实验步骤。如先前报告所述[24]，环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC材料实现了双重模式富集，允许...

结论

本研究提出了一种稳健且高效的分析方法，能够同时实现糖基化和磷酸化的高通量定量。通过整合简化的一管式样品处理工作流程和DiLeu同位素标记，我们简化了实验程序并减少了样品损失。作为原理验证实验，DiLeu-环氧-ATP-Ti⁴⁺-IMAC策略被应用于从AD小鼠大脑和WT样本中富集不同的PTMs。

CRediT作者贡献声明

王丹青：撰写——审阅与编辑、方法学、概念化。吴飞轩：撰写——初稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。刘远：撰写——审阅与编辑、资源准备。王子聪：撰写——审阅与编辑、资源准备。刘鹏凯：撰写——审阅与编辑、资源准备。迪伦·尼古拉斯·塔邦：撰写——审阅与编辑、方法学。李凌军：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理

未引用参考文献

[41]。

数据可用性

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢PolyLC公司的Christopher Wike提供环氧功能化的硅胶材料。本研究部分得到了NIH（R01AG052324、P41GM108538、R01AG078794和R01DK071801）的资助，以及威斯康星大学麦迪逊分校副校长办公室和威斯康星校友研究基金会的研究资助。Puglielli实验室得到了NIH的资助（R01NS094154、R01GM148487）...