SPARC：一种基于信号触发、自供给分层PER-转录-CRISPR级联技术的可编程分子诊断平台，用于早期检测肝细胞癌

《Analytica Chimica Acta》：SPARC: A Programmable Molecular Diagnostic Platform Based on a Signal-triggered, Self-supplied and Tiered PER-Transcription-CRISPR Cascade for Early Detection of Hepatocellular Carcinoma

SPARC是一种整合信号触发、PRIME交换、转录和CRISPR/Cas12a信号输出的模块化分子诊断平台，实现miRNA超灵敏检测（低至1.22 fM），可区分肝癌恶性与正常样本，与qRT-PCR和病理结果一致。

　　

Xinying Chang|Cong Han|Haishuo Ji|Zhe Zeng|Jingyi Yang|Qirui Liu|Chao Jia|Lili Zhao|Chunlei Zhou|Shujia Chen|Wolfgang Knoll|Jia Li|Zhenglu Wang|Liyun Zhang

中国天津市南开大学生命科学学院南开国际先进研究院（深圳福田）药物化学生物学国家重点实验室，邮编300350

摘要

背景

微小RNA（miRNA）的准确定量对于早期癌症检测至关重要，但由于其长度较短、丰度低以及序列相似度较高，这一任务仍然具有挑战性。现有的检测方法往往难以达到足够的灵敏度、特异性和稳健性，从而无法可靠地应用于临床实践。

结果

我们开发了一种名为SPARC的可编程分子诊断平台，该平台整合了信号触发引物交换反应、自供crRNA生成以及分层的PER-转录-CRISPR/Cas12a扩增级联反应。以miRNA-21作为模型，SPARC实现了1.22 fM的超低检测限，并覆盖了从1 fM到100 nM的广泛定量范围。该系统表现出高特异性、强的分析稳定性和对多种目标（包括miRNA-122）的模块化适应性。值得注意的是，对致癌miRNA和肿瘤抑制miRNA的双向分析提高了诊断分辨率。当应用于肝癌细胞系和临床组织时，SPARC能够准确区分恶性样本和正常样本，并与qRT-PCR测量结果和组织病理学评估结果高度一致。

意义

这种简化且具有自扩增能力的级联系统为超灵敏的miRNA检测提供了一个可扩展、稳健且临床适用的平台。SPARC在早期肝细胞癌筛查、分子亚型分类以及更广泛的精准肿瘤学应用中具有巨大潜力。

引言

肝细胞癌（HCC）是最常见的原发性肝癌类型，其全球发病率和死亡率呈上升趋势。这一趋势在乙型肝炎病毒（HBV）高发地区尤为明显，如亚洲[1]、[2]。HCC的发展主要受慢性病毒感染（如HBV和CV病毒）、肝硬化、长期饮酒以及多种代谢紊乱的影响[3]。HCC管理中的一个关键障碍是早期疾病通常无症状，导致在中晚期才被诊断出来，此时治愈性治疗选择有限。因此，全球的5年生存率仍低于20%[4]、[5]。目前的诊断策略主要依赖于影像技术和血清学生物标志物[6]、[7]。其中，甲胎蛋白（AFP）是最常用的标志物，但其灵敏度和特异性较低——尤其是在早期或AFP阴性的HCC中——导致频繁出现假阴性结果。其他候选生物标志物，包括脱γ-羧基凝血酶原（DCP）、AFP-L3、糖蛋白-3（GPC3）、高尔基蛋白73（GP73）和Dickkopf-1（DKK1）也已被研究，但没有一种能够提供足够的诊断准确性以实现可靠的早期检测[8]、[9]。影像学方法可以提供结构信息，但在识别小病灶方面存在局限性，并且受操作者和设备可用性的影响。这些限制凸显了对高度敏感、特异且易于获取的分子标志物的迫切需求。 微小RNA（miRNA）是一类内源性、非编码的小RNA分子，长度通常在18到24个核苷酸之间，在细胞增殖、分化和凋亡等多种生物过程中发挥关键的调节作用。越来越多的证据表明，miRNA在癌症的发生、进展和转移中起着重要作用[10]、[11]、[12]、[13]。与传统基于蛋白质的生物标志物相比，miRNA具有更高的组织特异性、动态响应性和在体液中的稳定性，使其成为HCC诊断的非常有前景的分子候选者[14]。在参与HCC调控的miRNA中，miRNA-21和miRNA-122尤为突出。miRNA-21在HCC和其他恶性肿瘤中经常过表达，促进肿瘤增殖、侵袭和转移；而miRNA-122在健康肝组织中占miRNA总量的70%以上，在HCC中显著下调，与不良预后和侵袭性肿瘤进展密切相关[15]、[16]。重要的是，虽然单一标志物的检测具有有限的诊断准确性，但同时分析上调的致癌miRNA（如miRNA-21）和下调的肿瘤抑制miRNA（如miRNA-122）可以提供更可靠和稳健的诊断方法。这种双向检测策略不仅能够早期和精确地区分恶性与非恶性肝病，还能更准确地分层疾病并进行预后评估。然而，由于miRNA的序列长度较短、表达水平低以及序列同源性高，其检测在技术上仍然具有挑战性，这些因素都使得在复杂的生物样本中实现高灵敏度和特异性变得复杂。传统的检测技术，如定量逆转录-聚合酶链反应（qRT-PCR）、Northern印迹和微阵列分析，虽然具有中等灵敏度和可靠性，但通常需要昂贵的仪器，涉及劳动密集型操作，并且周转时间较长，从而限制了它们在快速临床环境中的应用[17]、[18]、[19]、[20]。因此，开发一种高度敏感、特异且临床可行的miRNA检测平台具有重要的科学和转化意义。 近年来，等温扩增技术作为核酸检测领域的焦点受到了越来越多的关注[21]。常用的策略，如滚环扩增（RCA）[22]、[23]、重组酶聚合酶扩增（RPA）[24]、[25]和链置换扩增（SDA）[26]，已经显示出显著的应用价值。然而，这些方法在检测短核酸靶标时常常面临特异性降低和背景噪声增加的挑战。为了解决这些问题，研究人员开发了一种新的等温扩增策略——引物交换反应（PER）[27]、[28]。PER为短核酸提供了一个可编程且结构可控的扩增模块，从而在生物传感应用中具有明显优势。 在这项研究中，我们开发了一种名为SPARC的可编程分子诊断平台，该平台整合了四个功能不同的模块，这些模块以高度协调和无缝的方式协同工作，如图1所示：(I) 信号识别模块——识别探针（e）与目标miRNA（t）杂交形成t–e双链，从而释放出催化发夹链（CH）并触发特定的触发事件；(II) PER扩增模块——释放的CH链通过Bst DNA聚合酶催化引物交换反应（PER），通过高效的分支迁移产生大量DNA产物；(III) 转录模块——携带T7启动子的PER产物与crRNA模板杂交，并由T7 RNA聚合酶转录生成大量功能性crRNA，实现自供的信号放大过程；(IV) 信号输出模块——在转录的crRNA引导下，Cas12a形成活性Cas12a–crRNA–DNA复合物，非特异性地切割荧光报告探针，产生可测量的荧光信号。通过将这些四个模块整合到一个统一的多层级联反应中，SPARC实现了高灵敏度、特异性和可编程的miRNA检测。以miRNA-21作为模型分析物，该平台在细胞系和临床组织样本中均表现出优异的分析性能，能够可靠地区分肿瘤组织和正常组织。通过系统的优化和验证，SPARC建立了一个稳健且多功能的诊断框架，为肝细胞癌（HCC）的早期筛查和精准诊断提供了有力工具。

材料与试剂

所有寡核苷酸均由Sangon Biotech（中国上海）通过高效液相色谱（HPLC）合成并纯化，溶解在TE缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 8.0）中，并储存在-20 °C直至进一步使用（表S1）。T7 RNA聚合酶及其相应的10×NE Buffer r2.1购自New England Biolabs（NEB，美国）。TEMED、Bst DNA聚合酶（大片段）和RNase抑制剂购自Beyotime Biotechnology（中国上海）。FQ标记...

生物传感器设计

miRNA生物传感平台的整体设计如图1所示。为了实现对目标miRNA的高度特异性识别，设计了一种与目标序列互补的识别探针（e）。该探针通过15个核苷酸的互补序列与催化发夹（CH）的茎区杂交。目标miRNA与识别探针完全互补，竞争性地取代探针并触发发夹结构的有效打开...

结论

总之，我们开发了SPARC，这是一种可编程且模块化的分子诊断平台，它将引物交换反应、等温转录和CRISPR/Cas12a介导的信号转导整合到一个统一的多层扩增级联反应中。该系统引入了自供crRNA生成机制和级联扩增策略，共同克服了短核酸检测的固有挑战，实现了超灵敏、序列特异性的...

CRediT作者贡献声明

Zhenglu Wang：研究。 Haishuo Ji：验证、数据分析。 Zhe Zeng：研究。 Jingyi Yang：验证。 Qirui Liu：方法学。 Chao Jia：资源支持。 Lili Zhao：可视化。 Chunlei Zhou：数据分析。 Shujia Chen：验证。 Wolfgang Knoll：撰写、审稿与编辑、可视化。 Liyun Zhang：概念构思。 Jia Li：方法学。 Xinying Chang：概念构思。 Cong Han：数据分析。

注释

作者声明没有竞争性财务利益。

资金来源

本研究得到了国家重点研发计划（项目编号：2020YFA0907300）的支持。作者还感谢深圳市医学研究基金（项目编号：D2501007）、天津市自然科学基金的一般项目（项目编号：22JCYBJC01230）以及天津市关键医学学科建设项目（项目编号：TJYXZDXK-3-026C和TJYXZDXK-3-019B）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

Xinying Chang — 中国天津市南开大学生命科学学院南开国际先进研究院（深圳福田）药物化学生物学国家重点实验室，邮编300350。