《Animal Reproduction Science》：Manipulation of autophagy regulates mitochondrial homeostasis and early embryo development of cryopreserved porcine oocytes
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通过rapamycin（RAPA）和3-甲基腺嘌呤（3-MA）调控自噬，改善解冻后猪卵线粒体功能，发现RAPA可提升存活率、胚胎发育率及受精能力，而3-MA加剧损伤。研究证实自噬调节对维持线粒体稳态和胚胎发育的实用价值。
Jiehuan Xu|Mengqian He|Jun Gao|Lingwei Sun|Caifeng Wu|Shushan Zhang|Defu Zhang|Jianjun Dai
上海市农业科学院动物科学与兽医医学研究所农业遗传与育种重点实验室，中国上海201106
摘要
猪卵子在冷冻保存后会出现严重的线粒体损伤，这给解冻后的存活和随后的体外受精带来了挑战。自噬参与了冷冻保存的猪卵子在应激状态下的自我更新。在这项研究中，通过雷帕霉素（RAPA）或3-甲基腺嘌呤（3-MA）来调节玻璃化-解冻后的猪卵子的自噬，以评估自噬修饰在恢复解冻后线粒体功能障碍和受精能力方面的可行性。结果表明，RAPA诱导的自噬改善了线粒体膜电位（1.44 ± 0.06 vs 0.81 ± 0.07），抑制了氧化应激（0.91 ± 0.11 vs 1.46 ± 0.07）和早期凋亡率（23.74 ± 3.21% vs 46.78 ± 4.45%），提高了存活率（77.73 ± 4.24% vs 58.87 ± 4.05%）、孤雌生殖激活（PA）后的卵裂率（56.90 ± 2.97% vs 41.10 ± 3.71%）以及体外受精（IVF）后的囊胚率（10.93 ± 0.82% vs 2.63 ± 1.56%）。相比之下，3-MA抑制自噬会加剧线粒体功能障碍、氧化应激和早期凋亡，导致卵子存活率、孤雌生殖潜力和IVF能力的丧失，因此不具有实际应用价值。本研究将自噬的调节视为一种维持解冻后线粒体稳态并提高冷冻保存猪卵子IVF胚胎结果的应用策略。
引言
猪遗传资源是农业生物多样性的核心组成部分。然而，本地猪品种面临着种群减少、遗传多样性丧失和高近交系数等危机（Chen等人，2025年）。通过超低温暂停细胞生物活性的卵子和胚胎冷冻保存技术，有助于建立畜禽基因库（Kikuchi等人，2016年；Engdawork等人，2024年）。在主要畜禽中，牛胚胎和卵子的冷冻保存应用最为广泛（Dují?ková等人，2021年；Mogas等人，2024年）。它们的体外发育参数逐渐接近新鲜对照组（Ferré等人，2020年），冷冻保存胚胎移植的产犊率达到了约30%（Crowe等人，2025年）。山羊/绵羊卵子的冷冻保存方法也取得了显著进展（Zhu等人，2018年）。
相比之下，尽管多项研究证实玻璃化-解冻（快速冷却和融化）是猪卵子冷冻保存的有效方法（Somfai等人，2014年；Somfai等人，2023年），但仍存在重要的技术瓶颈。猪卵子含有大量的细胞质脂质，这与冷冻耐受性呈负相关（Almi?ana等人，2022年）。在低温下，脂质会发生相变，从液态转变为更固态（Amstislavsky等人，2019年），这会破坏与脂质滴紧密排列的线粒体膜（Sturmey等人，2006年）。增加的冰晶还会对亚细胞结构造成机械损伤。此外，玻璃化溶液的成分会导致渗透压应激和钙过载，从而引发线粒体应激和膜破裂（Ma等人，2021年）。简而言之，玻璃化-解冻后的猪卵子遭受了严重的物理损伤、渗透压应激和氧化应激。最突出的问题是其在解冻后的体外受精（IVF）和随后的体外胚胎培养（IVC）效率较低，目前尚不适合长期保存。一些机械方法被用于防止卵子冷冻损伤，例如通过离心后提取细胞内脂质。这种机械刺激会破坏透明带完整性，导致一定比例的猪卵子发生孤雌生殖激活，且在农场中难以应用。
人们尝试针对细胞生理机制和细胞器活动进行调控，以突破猪卵子冷冻保存的瓶颈。自噬是一种双刃剑机制，它在应激状态下维持细胞更新，从而保持细胞内生理功能和存活（Ortega等人，2024年）。在猪卵子中，缺乏自噬会破坏线粒体功能，触发DNA损伤反应，并影响成熟过程（Shen等人，2018年）。在机械和玻璃化应激条件下，猪卵子如何启动自我修复机制对其存活至关重要。自噬在冷冻损伤的响应下被激活，通过上调Beclin 1和微管相关蛋白1轻链3 beta（LC3B）的表达来形成自噬体，将受损成分包裹起来。自噬体的内容物随后被转移到溶酶体中进行降解。这一过程去除了受损的细胞器和蛋白质聚集体，同时也为解冻后的卵子提供了必要的能量和代谢前体。因此，本研究提出了针对冷冻损伤的自噬非侵入性调控策略。
线粒体在细胞能量代谢中起着关键作用，决定了卵子的成熟和胚胎的发育。我们之前的研究发现，冷冻保存会导致猪卵子线粒体损伤，表现为线粒体嵴的结构缺陷和线粒体去极化（Xu等人，2021b），进而导致细胞内ROS积累和凋亡激活（Dai等人，2015年）。针对线粒体的保护策略显示出潜在的应用前景。例如，添加二甲双胍作为线粒体温度调节剂可以减少冷冻保护剂和冰晶引起的膜流动性增加，从而防止膜破裂和细胞死亡（Zhou等人，2024年）。自噬与玻璃化-解冻引起的线粒体损伤之间存在负反馈调节机制，特别是通过PTEN诱导的激酶1（PINK1）/Parkin介导的线粒体自噬途径。我们的初步研究证实，冷冻保存后猪卵子中确实发生了线粒体自噬（Xu等人，2021b）。此外，PINK1/Parkin介导的线粒体自噬伴随着玻璃化-解冻后猪卵子氧化应激的变化（Xu等人，2021a）。PINK1在去极化的线粒体上积累，招募并磷酸化Parkin，使其泛素化多种线粒体膜蛋白。这些泛素信号被自噬受体识别，随后招募LC3阳性的自噬体膜（Wang等人，2023年）。这些自噬体随后在溶酶体中被降解。这一过程不仅清除了受损的细胞器，还促进了线粒体的生物合成和功能恢复。尽管有这些证据，但在解冻后短时间内调节哺乳动物卵子中特定线粒体自噬的方法仍然相对有限。目前尚不清楚通过增强自噬流来治疗冷冻应激下线粒体缺陷的潜在疗法。在这项研究中，我们首先验证了上调和抑制玻璃化-解冻后猪卵子中自噬的效果。然后，从线粒体功能障碍、氧化应激和早期凋亡的角度阐明了自噬调控的作用。之后，我们从三个方面确定了自噬调控剂的实际应用价值：细胞存活率、孤雌生殖胚胎发育和IVF后的早期胚胎发育。
材料与方法
除非另有说明，本研究中的所有化学试剂均从美国Sigma-Aldrich公司购买。
冷冻保存的猪卵子中自噬体形成的调控
通过分析用MDC染色的卵子的荧光强度来确定自噬体的数量（图1）。结果表明，玻璃化-解冻后卵子的自噬体荧光强度略有增加，但差异不显著（P > 0.05）。与玻璃化-解冻后的卵子相比，RAPA处理显著增加了自噬体的数量（P < 0.05）。3-MA处理则导致荧光强度显著下降
讨论
本研究表明，增强自噬可以促进冷冻保存的猪卵子解冻后的存活和早期胚胎发育。同时，本研究认为自噬不足是导致卵子冷冻保存后存活率和胚胎发育潜力下降的原因。在RAPA诱导的自噬过程中，受损的线粒体被包裹成自噬体并转移到溶酶体中进行降解，从而防止了ROS的持续释放
结论
RAPA诱导的自噬有助于维持玻璃化-解冻后猪卵子的线粒体稳态，缓解氧化应激和早期凋亡，从而提高解冻后卵子的存活率、孤雌生殖能力和IVF后的胚胎发育。抑制自噬会限制冷冻损伤线粒体的降解，降低解冻后卵子的存活率和生育能力。
资助
本研究得到了上海市科技创新行动计划（23YF1439000）、国家自然科学基金青年项目（32302698）和上海市农业科学院启动项目（ZP25172）的资助。
CRediT作者贡献声明
Jianjun Dai：项目管理、概念设计。Defu Zhang：监督。Jiehuan Xu：撰写——初稿、实验研究、资金申请。Jun Gao：软件开发、数据管理。Mengqian He：撰写——审稿与编辑、方法设计、实验研究。Caifeng Wu：资源准备。Lingwei Sun：数据可视化、数据分析。Shushan Zhang：结果验证。写作过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
作者声明本手稿未使用生成式AI技术。
致谢
不适用。
机构审查委员会声明
动物实验方案获得了上海市农业科学院动物伦理委员会的批准（批准编号：SAASPZ0523076），同时也符合美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南。
