《Aquaculture》：Integrative analysis of transcriptome dynamics and Notch signaling pathways reveals molecular basis of egg quality in
Plectropomus leopardus
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印度洋礁鲨（Plectropomus leopardus）高质量（GE）与低质量（LE）鱼卵在尾芽期、眼点期、孵化前期三个关键阶段的形态与转录组差异分析，发现GE在脂代谢和能量供应通路显著富集，而LE呈现炎症免疫相关通路（MAPK、TNF、IL-17、Notch）异常激活。WGCNA识别出核心基因（ddit4、dusp1、cebpd）共表达模块，Notch下游效应基因对雷帕霉素剂量响应验证了其调控作用，中等干预可有效提升胚胎发育和存活率，为蛋质分子育种提供新机制。
刘明健|王梦雅|金超凡|李家航|郑大|唐海展|翟忠义|鲍振民|王波|胡晶杰
中国海洋大学三亚海洋研究所海洋生命科学学院海洋遗传与育种国家重点实验室/海南省热带水生种质资源重点实验室，青岛/三亚，中国
摘要
卵子质量是决定海洋鱼类胚胎存活率和发育能力的关键因素，直接影响幼体产量和水产养殖生产力。然而，目前仍缺乏对胚胎发生过程中不同质量卵子之间分子差异的全面了解。在本研究中，选择Plectropomus leopardus作为研究物种，通过显微表型评估和时间序列转录组分析相结合的方法，系统比较了三个关键胚胎阶段的优质卵和低质卵（GE和LE）。结果表明，优质卵和低质卵在形态特征和转录组谱上存在明显差异，其中尾部萌芽阶段的差异最为显著。GO和KEGG富集分析表明，与炎症和免疫相关的通路（如MAPK、TNF、IL-17和Notch）在低质卵中持续激活，而优质卵则主要富集与脂质代谢和能量供应相关的通路。加权基因共表达网络分析（WGCNA）进一步确定了与卵子质量密切相关的共表达模块，并突出了几个关键调控基因，包括ddit4、dusp1和cebpd。Notch信号通路的验证表明，其下游效应子在20至80 μM的白藜芦醇处理下表现出剂量依赖性的表达响应。值得注意的是，适度干预有效改善了胚胎发育状况，提高了卵子质量和胚胎存活率，进一步支持了Notch通路在调节卵子质量中的关键作用。本研究揭示了卵子质量差异背后的转录调控机制，为早期海洋鱼类发育提供了机制见解，并有助于识别用于亲本优化和精准育种的分子标记。
引言
在鱼类早期发育阶段，卵子质量被广泛认为是决定胚胎存活率、成功孵化以及幼体健康和发育潜力的关键因素（Hansen等人，2022年）。优质卵通常具有更高的孵化成功率以及更好的幼体存活率和均匀性，这对于提高种子生产的效率至关重要（Barneche等人，2018年；Kj?rsvik等人，1990年）。随着水产养殖向高密度和集约化养殖系统的发展，配子质量的稳定性已成为有效育种计划发展的主要瓶颈（Bobe，2015年）。然而，即使在标准化的育种系统和良好的亲本管理条件下，卵子质量仍存在显著变异，同一批次内的发育潜力也存在明显差异（Kaththriarachchi等人，2025年）。一些卵子表现出早期发育异常的迹象，如胚胎轮廓不明显、卵黄不透明和细胞分裂不规则，最终导致孵化失败、畸形率增加和幼体生长不良（Riddle和Hu，2021年）。这些表型差异反映了卵母细胞内在发育能力的基本差异，很可能源于分子调控的差异。值得注意的是，在受精后早期阶段——在合子基因组激活（ZGA）之前——胚胎发育完全依赖于母源mRNA和蛋白质（Jukam等人，2017年），以及支持基本细胞功能的预先存在的代谢物。因此，阐明卵子质量背后的内在调控机制不仅有助于加深我们对鱼类发育生物学的理解，也为水产养殖中的配子质量评估和精准育种提供了理论基础。
近年来，随着高通量测序和系统生物学的进步，转录组分析已成为研究卵子质量调控分子机制的强大工具（Sullivan等人，2015年）。在多种鱼类中，研究人员构建了卵母细胞和早期胚胎的基因表达谱，识别出与发育能力密切相关的候选基因和信号通路。例如，在大西洋鲑鱼（Salmo salar）中的转录组分析显示，不同发育阶段的母源mRNA表达模式存在差异，反映了与胚胎发育相关的转录动态（Abdellaoui和Kim，2024年）。在虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）和斑马鱼（Danio rerio）中，脂质代谢酶、抗氧化蛋白和热休克蛋白的表达水平与孵化成功率显著相关（Coulibaly等人，2006年；Schnurr等人，2014年）。此外，经典信号通路如MAPK、mTOR、Wnt和Notch已被证明在卵母细胞成熟、细胞命运决定和早期胚胎发育中起关键作用（Binesh，2021年；Shi等人，2024年；Xiao等人，2024年）。尽管取得了显著进展，但大多数现有研究主要集中在单个发育阶段的静态分析上，对与卵子质量相关的动态转录变化了解有限。此外，转录组解释通常停留在单个基因或通路层面，缺乏对调控网络的整合。鉴于卵子质量的复杂性，结合系统生物学方法的时间序列转录组分析对于揭示全局基因表达模式和驱动胚胎能力的关键调控机制至关重要。
随着系统生物学的进步，将多阶段转录组数据与模块化分析框架相结合已成为揭示复杂发育过程分子机制的强大方法。加权基因共表达网络分析（WGCNA）能够识别与表型特征密切相关的表达模块，并有助于发现具有潜在调控重要性的枢纽基因，在水产养殖和发育生物学研究中得到广泛应用（Zhao等人，2018年）。此外，时间序列表达分析工具（如Short Time-series Expression Miner（STEM）能够表征动态转录轨迹，并提供发育过程中关键调控事件的时间洞察。尽管转录组在卵子质量研究中的应用日益增多，但大多数努力仍集中在有限阶段的静态比较上，缺乏对关键发育通路及其时间激活模式的系统验证（Fu等人，2019年）。例如，Notch信号通路——一种调控细胞命运和组织模式的进化保守机制——已被证实参与胚胎发生和卵母细胞成熟（Qu等人，2022年），但其对海洋鱼类卵子质量变异的动态响应和功能相关性仍需进一步探索。因此，构建高分辨率的转录图谱并结合基于网络的分析为解析卵子质量的调控架构提供了有希望的策略。
豹纹珊瑚石斑鱼（Plectropomus leopardus）是一种在印度-太平洋地区具有高商业价值的珊瑚礁鱼类，因其外观吸引人和营养价值而被广泛养殖。尽管在生长性能（Wu等人，2024年）、疾病抵抗力（Wang等人，2024年）、色素沉着（Jin等人，2024年）和生殖调控（Liu等人，2024年）方面取得了进展，但卵子质量波动和孵化率低等问题仍然是种子生产中的主要挑战。然而，从发育和动态转录组的角度来看，卵子质量变异的分子机制仍知之甚少。在本研究中，我们使用表型分析、RNA-seq、表达趋势分析、WGCNA和功能富集相结合的方法，研究了P. leopardus在三个关键胚胎阶段的优质卵和低质卵之间的分子差异。我们重点关注了低质卵中关键信号通路（特别是MAPK、TNF、IL-17和Notch）的失调，并验证了Notch下游基因对白藜芦醇处理的响应。我们的发现为卵子质量的调控框架提供了新的见解，有助于改进种质评估、种子选择和海洋水产养殖中的分子育种。
样本收集
样本收集
在海南省陵水近岸网箱中饲养了400条P. leopardus亲本，雌雄比例为3:1。通过自然产卵获得受精卵，仅选择漂浮的卵进行孵化。初步观察表明，卵子质量的差异在尾部萌芽阶段首次显现。因此，在三个发育阶段收集了样本：尾部萌芽期（受精后14小时30分钟，hpf）、孵化前（21小时）
胚胎质量的表型观察和统计分析
跨发育阶段的定量比较显示，优质卵的孵化前心率和孵化率显著高于低质卵（P<0.01），且优质卵孵化出的幼体显著较长（P<0.01）（图1B）。孵化后24小时内的异常卵率和死亡率在优质卵中明显低于低质卵（P<0.01）。两组之间的卵子直径没有显著差异。ATP含量始终
讨论
本研究系统比较了P. leopardus优质卵和低质卵在多个胚胎阶段的表型和转录组特征，揭示了在形态和分子水平上的显著差异。形态观察表明，优质卵和低质卵之间的卵子直径没有显著差异。卵子质量的差异基于包括胚胎组织、心脏节律和孵化情况在内的表型特征进行评估
结论
本研究提供了关于P. leopardus早期胚胎发育过程中卵子质量差异的分子基础的全面转录组见解。低质卵表现出关键信号通路（如MAPK、TNF、IL-17、Notch）的异常激活，这与细胞应激和发育调控受损有关。相比之下，优质卵在代谢和脂质转运通路中富集，支持正常的胚胎发生。通过WGCNA
CRediT作者贡献声明
刘明健：撰写——原始草稿，数据整理，概念构思。王梦雅：撰写——原始草稿，监督，方法学。金超凡：研究。李家航：研究。郑大：研究。唐海展：研究。翟忠义：研究。鲍振民：资源。王波：监督，资源。胡晶杰：资源，资金获取。
伦理声明
本研究中的动物实验按照中国海洋大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案进行。
未引用的参考文献
Bizuayehu等人，2019年
Ma等人，2019年
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（U24A20457）、海南省种子产业实验室（B23H10002）、海南省重点研发项目（ZDYF2023XDNY182）和国家自然科学基金（编号32202927）的支持。
