Munc13-1三聚体在PI(4,5)P2富集域组装并协同捕获突触囊泡的机制研究

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Synaptic transmission: Munc13 assembles onto PI(4,5)P2-rich domains into trimers that cooperate to capture vesicles

本研究发现Munc13-1通过形成三聚体（trimer）在PI(4,5)P2富集域中自组装，并高效捕获突触囊泡。通过单分子计数、冷冻电镜断层扫描（cryo-ET）和突变实验，证实三聚体是囊泡捕获的功能单元，且其向六聚体（hexamer）的构象转换受DAG调控。该研究揭示了突触囊泡快速释放（priming）的分子机制，为神经递质释放异常相关疾病提供了新靶点。

　　

Munc13 Binds Preferentially to the PI(4,5)P₂-Rich Domains

研究首先通过全内反射荧光显微镜（TIRF）观察Munc13-1在含有PI(4,5)P₂的脂质双分子层上的分布。当双分子层中存在Syntaxin-1A近膜区肽段（juxtamembrane peptide）时，PI(4,5)P₂会形成光学可见的簇状结构（平均面积约1.7 μm²），而Munc13-1（标记为Munc13C-Halo）特异性结合于这些PI(4,5)P₂富集域。若缺乏Syntaxin肽段，PI(4,5)P₂呈均匀分布且Munc13结合显著减少。粗粒化分子动力学模拟进一步证实，Syntaxin肽段通过其带正电残基与带负电的PI(4,5)P₂发生多价相互作用，促使PI(4,5)P₂在膜上聚集（域内密度提升约3倍）。这些结果说明Syntaxin肽段诱导的PI(4,5)P₂域形成是Munc13招募和寡聚化的前提。

Munc13 Predominantly Assembles into Trimers on PI(4,5)P₂–Rich Domains

为解析Munc13在PI(4,5)P₂域中的寡聚状态，研究者采用单分子光漂白计数法统计每个簇中Munc13的拷贝数。结果显示，野生型Munc13的拷贝数分布呈双峰（峰值位于4和7），与单纯单体随机分布（泊松分布）偏差显著。通过双泊松模型（单体+固定大小K聚体）拟合，发现仅当K=3（即三聚体）时，预测分布与实验数据高度吻合（拟合优度参数V和O均在K=3时达峰值）。此时，每个簇中平均含2.2个单体和1.5个三聚体。对比既往研究（DAG存在时Munc13以六聚体为主），表明PI(4,5)P₂域特异地促进Munc13三聚体形成。

Targeted Mutations That Destabilize the Upright Trimers Observed in Crystals Also Disrupt the Self-Assembled Putative Trimers

为验证上述三聚体是否与冷冻电镜（cryo-EM）中观察到的直立三聚体（upright trimer）同源，研究者引入三聚体界面突变Munc13^{K1495D/K1500D}（该突变破坏MUN结构域间静电相互作用，已知可消除晶体中的直立三聚体但不影响六聚体）。突变体仍能结合PI(4,5)P₂域，但其拷贝数分布转为以六聚体为主（峰值移至8和14），且统计拟合最优K值变为6。这表明天然三聚体依赖特定界面组装，而界面破坏后Munc13被迫以六聚体形式存在，进一步证实PI(4,5)P₂域中自组装三聚体与晶体结构的一致性。

Upright Trimers Are Directly Observed by Cryo-Electron Tomography of Functionally Reconstituted Membranes

通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）直接观察重构的巨型单层囊泡（GUVs，模拟突触前膜）表面Munc13的组装。GUVs包含Syntaxin-1–Munc18复合物、棕榈酰化SNAP25及6 mol% PI(4,5)P₂。断层图像显示，Munc13在膜上形成明显的三角形结构（边长约26 nm），其顶点为单个Munc13分子延伸出的棒状密度。将已知直立三聚体原子模型（PDB 7T7X）对接到三维重构体积中，可完美匹配这些三角形组装体，证实其为直立三聚体。这些三聚体通过C₂B域锚定于膜，C₂C域朝向胞浆以捕获囊泡，且常以簇形式存在（如双三聚体单元），提示多价相互作用增强囊泡结合能力。

Vesicles Bind to Clusters of 3 or More Upright Trimers of Munc13 in the PI(4,5)P₂-Rich Domains

功能实验表明，含磷脂酰丝氨酸的小单层囊泡（SUVs）仅当Munc13和Syntaxin肽段共存时才能结合PI(4,5)P₂域。通过量化Munc13拷贝数与囊泡结合概率的关系，发现当簇中Munc13拷贝数N≥3时囊泡结合概率显著上升，且结合曲线呈三阶梯状：1个三聚体结合概率为0.17，2个三聚体升至0.55，≥3个三聚体时达1.0。若引入C₂C域突变（R1598E/F1658E，已知破坏囊泡结合），结合概率骤降（2个三聚体时仅0.09）。而三聚体界面突变体（主要形成六聚体）则呈现“以6为单元”的结合模式，单六聚体结合概率为0.8。这些数据说明三聚体是囊泡捕获的功能单元，且协同作用需至少3个三聚体簇。

Discussion

总结认为，Munc13-1在PI(4,5)P₂富集的Syntaxin纳米域中组装为直立三聚体，并通过C₂C域高效捕获突触囊泡。三聚体向六聚体的构象转换可能由DAG（PI(4,5)P₂水解产物）驱动，使囊泡与膜间距从约20 nm（三聚体）缩短至12 nm（六聚体），为SNAREpin（SNARE复合物）组装创造条件。该模型合理解释了囊泡快速启用的两阶段机制：捕获（三聚体）与激活（六聚体）。研究还强调PI(4,5)P₂域的形成是三聚体组装的前提，且Syntaxin肽段模拟了体内Syntaxin的成域作用，确保囊泡 docking 于SNARE富集区。这一发现对理解突触可塑性异常相关疾病（如神经退行性疾病）具有重要启示。