一种基于生物界面工程设计的金纳米簇平台，用于伊卡瑞林（icariin）的递送：在骨质疏松症治疗中通过双途径调节成骨细胞和破骨细胞的活性

《Biomaterials Advances》：A biointerface-engineered gold nanocluster platform for icariin delivery: Dual-pathway modulation of osteoblast and osteoclast dynamics in osteoporosis therapy

本研究开发β-环糊精修饰金纳米颗粒（CGNCs）作为伊卡里因（ICA）递送系统，解决其低溶解度和生物利用度问题。体外实验证实ICA-CGNCs促进成骨分化（ALP活性、矿化结节、Runx2表达）并抑制破骨细胞分化（TRAP减少、NFATc1降低）。体内模型（斑马鱼）显示其有效促进颅骨和椎骨矿化且无系统毒性，优于游离ICA和CGNCs单独使用。结论：ICA-CGNCs为骨再生双效纳米疗法提供新策略。

　　

王长旭|史胜浩|王飞|袁冲|刘迪|刘一飞

湖北中医药大学药学院，武汉，430065，中国

摘要

骨质疏松症是一种常见的代谢性骨疾病，其特征是骨吸收与骨形成之间的失衡。目前的治疗方案受到副作用和低生物利用度的限制。淫羊藿素（ICA）是一种天然提取的促骨生成黄酮类化合物，具有促进骨形成和抑制破骨细胞生成的特性；然而，由于其溶解度低和口服生物利用度低，其临床应用受到限制。本研究引入了β-环糊精修饰的金纳米簇（CGNCs）作为ICA的有效递送载体。合成的ICA负载CGNCs（ICA-CGNCs）的流体动力学直径约为2.16纳米，表现出优异的分散性、持续释放动力学和储存稳定性。体外实验表明，ICA-CGNCs在MC3T3-E1前成骨细胞和RAW264.7巨噬细胞中具有良好的细胞相容性。在MC3T3-E1细胞中，ICA-CGNCs促进了骨形成分化，表现为ALP活性增加、矿化增强以及骨形成相关基因（ALP、BMP2、RUNX2和COL1A1）上调；免疫荧光进一步显示核β-连环蛋白和RUNX2信号增强，支持骨形成途径相关事件在该细胞模型中的作用。在RAW264.7细胞中，ICA-CGNCs通过减少TRAP阳性的多核破骨细胞形成、破坏F-肌动蛋白环结构以及下调破骨细胞标志物（TRAP、CTSK、MMP9和NFATc1）来抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，这通过减少骨吸收坑的形成和NF-κB p65及NFATc1的核积累得到证实。在糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型中，ICA-CGNCs有效促进了颅骨和椎骨的矿化，且没有全身毒性，其效果优于游离ICA或单独使用CGNCs。本研究确立了ICA-CGNC平台作为一种具有显著治疗骨质疏松和骨再生潜力的双作用纳米治疗策略。

引言

骨质疏松症是一种骨骼疾病，其特征是骨骼变弱和骨折风险增加，对公共卫生构成重大挑战，尤其是在老年人群中[1]、[2]。该病是由于骨重塑过程中的不平衡导致的，即破骨细胞的吸收超过成骨细胞的形成，从而引起骨量丢失和微结构恶化[3]、[4]。目前的治疗方法（如双膦酸盐和狄诺单抗）主要是抗吸收的，但存在诸如颌骨坏死和非典型骨折等副作用，以及生物利用度和患者依从性方面的问题[5]、[6]。促骨生成剂（如特立帕肽）由于成本高昂和特定的给药要求而受到限制[7]。这些挑战凸显了需要更安全、更有效、多靶点的疗法，既能促进骨形成又能抑制骨吸收[8]、[9]。

天然化合物作为替代疗法受到了关注。淫羊藿素（ICA）是从传统中药淫羊藿中提取的黄酮类化合物，在治疗骨质疏松方面显示出潜力。研究表明，ICA能够促进间充质干细胞和成骨细胞的骨形成分化[10]、[11]，并通过清除活性氧和调节Cullin 3/Nrf2等通路来抑制破骨细胞生成和骨吸收[12]、[13]。ICA还存在于淫羊藿衍生的细胞外囊泡样颗粒中，这些颗粒具有天然的骨靶向能力[14]、[15]。然而，由于其口服生物利用度低、溶解度差和代谢迅速，其临床应用受到限制，需要先进的递送系统。

纳米技术——尤其是超小金纳米簇（GNCs）——提供了一个紧凑、生物相容且易于功能化的平台，可用于骨质疏松治疗，既可作为促骨生成/抗吸收剂，也可作为多功能药物载体[16]、[17]、[18]。溶菌酶保护的Au纳米簇能够增强MC3T3-E1细胞的增殖和骨形成分化，同时抑制RANKL驱动的破骨细胞生成，这与PI3K/Akt信号通路有关[19]。配体工程可以增强疏水性物质（如淫羊藿素）的递送；例如，β-环糊精/姜黄素修饰的AuNPs可以抑制肌动蛋白环的形成和NFATc1/c-Fos，防止OVX模型中的骨丢失[20]。由α-硫辛酸稳定并与阿仑膦酸结合的?ngstr?m级Au颗粒能够实现骨靶向和WNT激活，恢复微结构而不表现出明显的毒性[21]。表面结合的维生素D进一步促进了人类ADSCs的骨形成，突显了配体引导的骨免疫调节作用[22]。除了直接作用于骨细胞外，Au系统还能重新编程全身代谢轴：金纳米球通过调节肠道微生物群和降低TMAO来减轻骨丢失[23]，而AuNPs通过增强微生物群-肠道-关节途径中的SCFAs和M2极化来促进骨形成——这些原理可应用于骨骼保护[24]。值得注意的是，将物理刺激与AuNPs结合使用可以优化体内的炎症微环境并增强骨形成过程[25]。最后，双功能化AuNP的颜色测定方法为基于Au的纳米制剂提供了可扩展的质量控制分析[26]。

综上所述，这些发现表明，合理设计的Au纳米簇不仅可以调节骨重塑，还可以作为疏水性促骨生成剂的有效载体，特别是当利用表面配体（如环糊精）进行负载和控释时——这激发了我们在本研究中设计的ICA×Au簇组合[3]、[20]、[21]、[22]。在本研究中，我们采用一锅法合成了β-环糊精修饰的金纳米簇（CGNCs），利用β-环糊精的化学性质实现了ICA的有效封装。所得ICA负载CGNCs（ICA-CGNCs）具有小尺寸、球形结构、高分散性、成功的ICA结合和持续释放特性。ICA-CGNCs表现出优异的生物相容性，并在MC3T3-E1前成骨细胞中促进了骨形成分化，同时在RAW264.7细胞中抑制了RANKL诱导的破骨细胞生成。我们还在斑马鱼（Danio rerio）模型中评估了ICA-CGNCs的有效性和安全性，结果显示适当浓度能够促进颅骨矿化和骨量积累，且没有全身毒性[27]。这项综合研究强调了工程化ICA-CGNC平台在骨再生方面的潜力，并旨在通过结合天然化合物的特性和功能性纳米载体，为骨质疏松的治疗提供创新的纳米治疗策略。

材料

三水合氯化金（HAuCl?·3H?O，99.9%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），单-(6-巯基-6-脱氧)-β-环糊精（β-CD-SH，≥98%）购自Aladdin（中国上海）。淫羊藿素、钙黄绿素、罗丹明6G和Triton X-100也由Aladdin提供。用于斑马鱼染色的Alizarin Red S购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（中国上海），而用于细胞矿化测定的Alizarin Red S则购自OriCell（中国苏州）。

ICA-CGNCs的合成与表征

在碱性条件下，通过一锅法将HAuCl?与β-CD-SH反应并负载淫羊藿素（ICA），成功合成了β-环糊精修饰的金纳米簇（CGNCs）（图1a）。透射电子显微镜（TEM）图像（图1b）显示，β-环糊精修饰的金纳米簇（CGNCs）和负载了ICA的CGNCs（ICA-CGNCs）体积极小且分布均匀，没有聚集现象。CGNCs表现出明确的

讨论

有效的骨质疏松治疗需要恢复骨形成与吸收之间的平衡。我们的研究结果表明，ICA-CGNCs通过调节成骨细胞和破骨细胞的活性实现了这一目标。与游离ICA相比，β-环糊精修饰的金纳米簇系统显著提高了ICA的溶解度、稳定性和细胞摄取，解决了其药代动力学问题，并促进了持续的细胞内递送。这种生物利用度的提高得到了我们的实验结果的支持

结论

总结来说，我们开发了负载淫羊藿素的β-环糊精修饰金纳米簇（ICA-CGNCs），作为一种生物相容的纳米平台，旨在协调调节成骨细胞和破骨细胞的活性以治疗骨质疏松症。ICA-CGNCs具有超小尺寸、均匀分布和持续的药物释放特性。它们在体外有效促进了骨形成分化，同时抑制了RANKL诱导的破骨细胞生成。在糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型中，

CRediT作者贡献声明

王长旭：撰写——原始稿件、可视化、方法学、实验设计、数据分析、概念构思。史胜浩：撰写——审稿与编辑、验证、实验设计、数据分析。王飞：撰写——审稿与编辑、可视化、实验设计、数据分析。袁冲：验证、资源协调、实验设计、数据分析。刘迪：撰写——审稿与编辑、验证、项目监督、方法学设计、概念构思。刘一飞：

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢湖北中医药大学重点计划（项目编号：2023ZDXM006）提供的关键资源和研究条件，这些资源对研究起到了重要支持作用。作者还感谢湖北石珍实验室首席科学家研究项目（项目编号：HSL2024SX0006）在实验平台、技术支持和分析设施方面的支持。此外，优秀青年和中年人才也提供了额外支持