《Bioorganic Chemistry》：Rational β-turn engineering of a disulfide-free β-hairpin-like antimicrobial peptide W2PG with enhanced stability, selectivity, and
in vivo efficacy
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本研究通过β-发夹工程策略设计了一种不含二硫键的短小抗菌肽W2PG，其具有广谱抗菌活性（MIC 4–8 μM）、低溶血/细胞毒性及优异的胃肠道和血清稳定性。分子动力学模拟显示其通过芳香族残基锚定并穿透细菌外膜，动物模型验证其疗效与多粘菌素B相当且无显著毒性。
Meng Liu|Peng Jiang|Binghui Ruan|Yunfei Cui|Junjie Zhang|Yuxiu Ye|Dongting Zhangsun|Sulan Luo|Yong Wu
广西医科大学医学院特殊生物医学重点实验室，中国南宁530004
摘要
抗菌素耐药性（AMR）是一个日益严重的全球性问题，而新型抗生素的研发进展却十分有限。抗菌肽（AMPs）由于其广谱性和针对膜的作用机制而成为一种替代方案，但其应用受到不稳定性和细胞毒性的限制。本文介绍了一种β-转角工程策略，通过引入Pro-Gly基序和芳香族残基，制备出一种短链、无二硫键的β-发夹结构抗菌肽（W2PG）。W2PG表现出广谱抗菌活性（最小抑菌浓度为4–8 μM），同时具有较低的溶血性和细胞毒性，并且蛋白酶稳定性和血清稳定性得到了提升。实验结果表明，该肽能够依赖浓度诱导膜通透性和细胞去极化，分子动力学模拟也证实了芳香族残基在锚定和稳定肽结构中的作用。在小鼠感染模型中，W2PG的疗效与多粘菌素B相当，且未观察到明显的器官毒性。这些结果表明，基于β-转角的设计方法可以平衡稳定性、选择性和抗菌活性，为抗菌肽的开发提供了有用的框架。
引言
抗菌素耐药性（AMR）已成为二十一世纪最严重的全球健康挑战之一[1]。据预测，如果现有趋势持续下去，到2050年每年可能因AMR导致1000万人死亡[2][3]。尽管形势紧迫，但近年来成功进入临床应用的新抗生素数量却大幅减少，这凸显了迫切需要开发替代抗菌策略[4]。
在新兴方法中，抗菌肽（AMPs）因独特的作用机制、广谱抗菌效果以及较低的耐药性发展倾向而受到越来越多的关注[5][6]。天然存在的抗菌肽在多种生物体中广泛分布，为药物发现提供了丰富的分子资源[7]。然而，由于复杂的三级结构、潜在的全身毒性、较差的蛋白酶稳定性和高昂的生产成本，其临床应用受到限制[8][9]。相比之下，通过理性优化设计的短链合成肽具有结构可调性、易于化学修饰以及强效的广谱抗菌活性，成为下一代抗感染治疗药物的理想候选者[10]。在各种抗菌肽结构中，β-发夹结构因其内在的刚性构象、酶稳定性及选择性的膜破坏能力而被认为是特别有前景的骨架[11][12]。从结构上看，β-发夹结构由两条反平行β链通过一个中央β-转角连接而成，这种结构将阳离子和疏水残基分别分布在两侧，形成了有利于与细菌膜发生静电和疏水相互作用的两亲性拓扑结构[13]。这种双面结构使β-发夹肽能够高效破坏细菌膜，同时将对哺乳动物细胞的毒性降到最低[14]。然而，β-发夹肽的更广泛应用受到其内在构象不稳定性的限制[15]。为了提高稳定性，通常采用二硫键进行共价连接以增强肽链的折叠[16]，但这种方法显著增加了合成复杂性和生产成本。值得注意的是，先前的研究表明，去除某些天然β-发夹结构中的二硫键并不一定会影响其结构完整性和生物活性，因为这些性质可以通过序列优化得以维持[17][18]。这些观察结果表明，非共价稳定化方法可以作为共价连接的替代方案[19]。特别是色氨酸（Trp）可以通过与Trp或Phe等氨基酸的相互作用形成疏水作用和π–π堆叠，从而帮助肽链形成稳定的二级结构[20][21]。然而，在短链线性肽中同时整合刚性β-转角诱导基序和非共价稳定基序，同时保持良好的两亲性和选择性，仍然是一个巨大的设计挑战[22]。
在这项工作中，我们对之前报道的β-发夹结构进行了改进，得到了WXPGWX骨架，优化了其结构稳定性和抗菌性能[21][23]。该骨架包含了三个关键的药理化学特征：中央转角处的刚性Pro-Gly（P–G）二肽通过β-转角诱导促进主链折叠；位于P–G基序两侧的Trp或Phe通过π–π堆叠和π-阳离子相互作用稳定肽结构；可调节的两亲性片段（X）由交替的疏水性和阳性残基组成，并富含阳离子氨基酸和芳香族氨基酸，我们的先前研究已证明它是有效的抗菌肽片段[24]。
本研究采用的结构设计策略如图1所示。从这些候选分子中，我们筛选出了W2PG，它具有广谱抗菌活性、快速的杀菌动力学、低溶血性和细胞毒性，在模拟的胃肠道液和血清中表现出优异的酶稳定性。机制研究表明，W2PG通过插入细菌外膜来发挥杀菌作用，导致膜电位迅速去极化和细胞内物质泄漏。分子动力学模拟进一步证实了这一机制，揭示了芳香侧链相互作用在膜锚定、插入和稳定过程中的作用。在小鼠腹膜炎和皮肤感染模型中，W2PG的疗效与多粘菌素B相当，且未观察到全身毒性。综上所述，W2PG是一种在化学和生物学上都非常稳健的β-发夹结构抗菌肽，能够在结构紧凑性、生物活性和安全性之间取得平衡。本研究证明，基于β-转角的设计结合Trp介导的非共价稳定化方法是一种可行的策略，可用于开发稳定且高效的抗菌肽，从而扩展下一代抗菌药物的化学工具箱。
材料
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、盐酸、三氟乙酸（TFA）、乙基2-氰基-2-（羟基亚氨基）乙酸酯（Oxyma）、N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）、二甲基亚砜（DMSO）、吡啶、头孢哌酮钠、多粘菌素B硫酸盐、万古霉素、DAPI、3,3'-二丙基硫代吖啶碘化物[DiSC3(5)]、N-苯基-1-萘胺（NPN）和PI均购自上海阿拉丁试剂有限公司（中国）。卡那霉素硫酸盐购自上海海星钻石公司。
肽系列的合成与表征
在本研究中，使用Rink酰胺MBHA树脂和标准的Fmoc固相肽合成（SPPS）方法合成了六种肽（WPG、W2PG、W3PG、W4PG、W5PG和W6PG），得到C端酰胺化的肽序列。所有肽的鉴定和纯度通过电喷雾离子化质谱（ESI-MS）和分析型反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行验证（见图S1、图S2和表S1）。
结论
本研究成功设计并开发了一种短链、无二硫键的β-发夹结构抗菌肽W2PG，它在结构稳定性、强效抗菌活性和生物相容性方面取得了平衡。通过对比不同肽序列，发现W2PG是对抗革兰氏阳性和阴性病原体最有效的候选分子，表现出广谱抗菌活性。
声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT来提高语言表达的清晰度并检查语法和拼写错误。使用该工具/服务后，作者对内容进行了必要的审核和编辑，并对发表文章的内容负全责。
CRediT作者贡献声明
Meng Liu：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化设计、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。
Peng Jiang：方法学设计、实验设计、概念化。
方法学设计、实验设计、概念化。
Yunfei Cui：方法学设计、实验设计、概念化。
Junjie Zhang：方法学设计、实验设计、概念化。
Yuxiu Ye：方法学设计。
Dongting Zhangsun：项目管理、资金申请。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32170534）、广西自然科学基金（项目编号：2025GXNSFAA069562）、广西百贵青年人才培训计划、国家重点研发计划重大国际合作项目（项目编号：2022YFE0132700）、国家自然科学基金重大国际合作项目（项目编号：82320108019）、国家自然科学基金（项目编号：42376112和82360698）以及其他相关项目的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
同时感谢Figdraw公司的支持。
